小麦抗穗发芽分子标记的发掘与验证

论文摘要

穗发芽（Pre-harvest sprouting,简称PHS）是指小麦在收获前的穗上发芽。小麦收获前穗发芽不但影响产量,而且严重影响加工品质,造成不同程度经济损失。穗发芽是国内许多地区面临的主要问题,培育抗穗发芽品种是主要育种目标之一。小麦对穗发芽的抗性是多种机制、多基因控制的综合性状,种子休眠性是其主要机制之一。ABA在穗发芽抗性机制中起重要作用,它在成熟期分解代谢过程中的关键步骤是在ABΑ-8’羟化酶的作用下形成PA（Phaseic acid）,CYP707A1及其家族中的其他基因在这一过程中起到重要作用。本研究克隆了小麦ABA-8’羟化酶基因TaCYP707A1,发掘且验证了一个与穗发芽抗性密切相关的STS标记Dorm-1,并利用该标记对国内外618份小麦品种（系）的穗发芽抗性进行了筛选。同时,本研究还利用光周期、PPO活性及黄色素含量的相关基因标记对黑龙江省95份小麦品种进行了检测。主要结果如下:1.以大麦ABA-8’羟化酶基因HvCYP707A的cDNA序列（GenBank登录号AB239299）为探针进行BLAST检索,获得相似性很高的小麦EST序列,并将其拼接成1个跨叠群。根据跨叠群序列设计引物,扩增小麦ABA-8’羟化酶基因TaCYP707A1全长。TaCYP707A1的基因组DNA序列由2225个碱基对组成,包括5个外显子和4个内含子,以及部分5’和3’非翻译区。TaCYP707A1的cDNA全长为1737 bp,包含一个1431 bp的开放读码框,一个42 bp的5’非翻译区和264 bp的3’非翻译区。它与大麦HvCYP707A1基因（AB239299）的cDNA序列具有94.9%的一致性。系统发育树表明该基因的推导氨基酸序列与大麦和水稻具有很高的相似性。利用一套中国春缺体-四体系以及双端体DT6BS将该基因定位于6BL染色体。2.在克隆小麦ABA-8’羟化酶基因TaCYP707A1全长时发现一个与休眠有关的新基因,命名为Dorm-B1,根据该基因在穗发芽抗、感品种间的差异,开发出一个与抗穗发芽相关的共显性STS标记,命名为Dorm-1。该标记在大多数抗穗发芽品种中扩增出606 bp片段,而在绝大多数感穗发芽品种中扩增出468 bp片段。利用一套中国春缺体-四体系以及双端体DT7BL将该标记定位于7BL染色体。利用104份白粒小麦材料对该标记进行了验证,表明GI×100值大于31.00的66份材料全部扩增出468 bp的片段;GI×100值小于11.00的17份材料全部扩增出606 bp片段;GI×100值介于11.0031.00的21份材料中有13份扩增出468 bp片段,8份扩增出606 bp片段。以Dorm-1标记的606 bp和468 bp两类扩增条带作为分类依据,扩增出468 bp的材料GI×100平均值为43.79±15.42,而扩增出606 bp的材料GI×100平均值为11.91±7.92,差异达1%显著水平（F=498.96,P<0.0001）。表明该标记可以应用于抗穗发芽分子标记辅助育种。3.利用Dorm-1标记对国内外618份小麦资源的穗发芽抗性进行了分子检测。表明Dorm-1标记在国内外材料中均表现出多态性,且606 bp抗性特异条带所占比例基本相同,分别为8.5%和7.9%。这说明当前小麦品种及种质资源穗发芽抗性水平偏低。本研究还证明Dorm-1标记在红粒小麦品种中也存在多态性,其检测结果与生产实践相吻合。4.对黑龙江省95份历史品种和目前主栽品种的光周期、PPO活性及黄色素含量进行了分子检测,表明73.7%的供试品种具备光敏感特性,这主要是由该地区特定的生态条件所决定;黑龙江省小麦品种的PPO-2A及PPO-2D位点高PPO活性条带频率偏高,分别为51.8%和42.2%,两个位点都出现高PPO活性条带的品种有19份,占23.8%;都出现低PPO活性条带的品种有23份,占28.8%。有6份品种在PPO-2A位点出现杂合现象,这可能与育种中没有施加相应性状选择压力有关;在Psy-A1位点控制低黄色素含量的等位基因Psy-A1b的材料在黑龙江省小麦中的分布频率为58.9%,而控制高黄色素含量的等位基因Psy-A1a的材料在黑龙江省小麦中的分布频率为41.1%,说明黑龙江省小麦品种Psy-A1位点以Psy-A1b为主。但从单个品种上看,当前该省主栽小麦品种及骨干亲本却大多以高黄色素含量的等位基因Psy-A1a为主,如龙麦26、龙麦30、龙辐麦12、龙辐麦16、克旱18、克旱19、克旱20等。而克丰6号、克丰10号、克丰12号及龙辐麦15为低黄色素含量的等位基因Psy-A1b类型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 穗发芽及其危害
• 1.2 生理生化过程
• 1.2.1 成熟干燥诱导种子发育与萌发的转换
• 1.2.2 种子萌发与基因甲基化
• 1.2.3 穗发芽过程中储藏物质代谢
• 1.3 小麦收获前穗发芽抗性鉴定方法
• 1.4 穗发芽的抗性机制
• 1.4.1 籽粒休眠与穗发芽抗性
• 1.4.2 α-淀粉酶的合成与小麦穗发芽抗性
• 1.4.3 α-淀粉酶抑制蛋白与穗发芽抗性
• 1.4.4 迟熟α-淀粉酶（LMA）与穗发芽抗性
• 1.4.5 其它因素对小麦收获前穗发芽抗性的影响
• 1.5 小麦收获前穗发芽抗性的遗传
• 1.5.1 籽粒休眠性
• 1.5.2 粒色
• 1.5.3 α-淀粉酶合成能力
• 1.5.4 α-淀粉酶抑制蛋白
• 1.5.5 迟熟α-淀粉酶（LMA）
• 1.6 抗穗发芽的分子标记辅助选择
• 1.6.1 分子标记辅助选择（MAS）在作物育种中的应用
• 1.6.2 抗穗发芽的分子标记辅助选择
• 1.7 研究的目的和意义
• 第二章 小麦TACYP707A1 基因的同源克隆
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 普通小麦TaCYP707A1 基因的克隆及序列分析
• 2.2.2 系统发育树的构建
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 小麦TaCYP707A1 基因的克隆及其序列分析
• 2.3.2 系统发育树的构建与序列分析
• 2.3.3 TaCYP707A1 基因的染色体定位
• 2.4 讨论
• 第三章 小麦抗穗发芽功能标记的发掘与验证
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 田间试验设计及穗发芽抗性鉴定
• 3.2.2 引物设计
• 3.2.3 DNA 提取及PCR 扩增
• 3.2.4 序列分析
• 3.2.4 统计分析
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 抗、感穗发芽品种间差异序列分析
• 3.3.2 抗穗发芽功能标记Dorm-1 的发掘
• 3.3.3 Dorm-1 及其相应的Dorm-81 基因染色体定位
• 3.3.4 STS 功能标记Dorm-1 的验证
• 3.4 讨论
• 第四章 主要小麦资源穗发芽抗性的分子检测
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 供试标记
• 4.2.2 DNA 提取及PCR 扩增
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 第五章 黑龙江省主要小麦品种三个重要性状的分子检测
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 供试引物
• 5.2.2 DNA 提取及PCR 扩增
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 Ppd-D1 的检测
• 5.3.2 PPO 活性基因在黑龙江省小麦品种中的分布
• 5.3.3 黄色素的分子检测
• 5.4 讨论
• 5.4.1 黑龙江省小麦光周期特点及变化趋势
• 5.4.2 多酚氧化酶活性基因在黑龙江省小麦品种中的分布特点
• 5.4.3 黄色素基因在黑龙江省小麦品种中的分布特点
• 第六章 全文结论
• 6.1 TaCYP707A1 基因的同源克隆
• 6.2 小麦抗穗发芽功能标记发掘与验证
• 6.3 国内外小麦资源穗发芽抗性的分子检测
• 6.4 黑龙江省主要小麦品种光周期、PPO 活性及黄色素含量的分子检测
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历