毕赤酵母分泌表达人碱性成纤维细胞生长因子（hu-bFGF）的研究

论文摘要

碱性成纤维细胞生长因子（basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）又称FGF-2,是成纤维细胞因子家族的一个重要成员,它是一种具有很强的促进细胞生长、广泛的生物学作用的多肽因子。目前,bFGF不仅在治疗神经系统疾病、冠心病、烧伤、创伤、各种损伤疾病和眼科疾病等方面展示了新的功效,而且在护肤美容领域也显示了广阔的应用前景,被誉为“二十一世纪的化妆品”。本研究通过PCR技术从pMD18-T/hu-bFGF质粒中扩增出hu-bFGF基因,并将其克隆到pMD19-T Easy载体中。经测序鉴定后,通过Xho I和Xba I以正确的阅读框插入到pGAPZα-A的α-factor信号肽下游,构建成pGAPZα-A/hu-bFGF重组分泌型表达载体。表达载体用Bln I线性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,转化子经Zeocin抗性筛选、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE复筛获得6株分泌型表达hu-bFGF的工程菌株,再经高Zeocin抗性梯度筛选、SDS-PAGE鉴定,获得1株高效表达菌株Yb5。以Yb5为发酵菌株,对发酵条件进行优化,并确立了最佳发酵条件:发酵培养基配方为酵母浸出粉3%、蛋白胨2%、麦芽糖5%;最佳表达时间:96h;最适初始pH:6.5;最适接种量范围:1: 500～1:50（接种量:培养基）;最适装液量:≤10%（培养基体积:容器容量）。优化后,重组蛋白的表达水平为2.10mg/mL,占分泌蛋白的30%左右。Western Blot结果表明,重组蛋白能够与兔抗人bFGF抗体发生特异性反应,具有与天然bFGF同样的免疫原性。本研究结果不仅为发酵罐发酵条件的优化提供了技术依据,而且也为工业化生产碱性成纤维细胞生长因子和临床应用奠定了一定的基础,具有重要的理论和实践意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 碱性成纤维细胞生长因子 bFGF 蛋白的研究进展
• 1.1 bFGF 的结构
• 1.2 bFGF 的药理作用
• 1.2.1 bFGF 在创伤愈合及软骨组织的修复作用
• 1.2.2 bFGF 与心血管疾病关系
• 1.2.3 bFGF 对神经系统的营养作用
• 1.2.4 bFGF 与肿瘤的关系
• 1.3 bFGF 的作用机理
• 1.4 bFGF 的重组生产
• 1.5 展望
• 2 巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展
• 2.1 表达系统的主要特征
• 2.2 表达系统的组成
• 2.2.1 表达载体
• 2.2.1.1 启动子
• 2.2.1.2 选择标记
• 2.2.2 表达载体的种类
• 2.3 巴斯德毕赤酵母菌株类型
• 2.3.1 巴斯德毕赤酵母的表型
• 2.3.2 蛋白酶缺陷型毕赤酵母
• 2.4 分泌型外源蛋白的修饰
• 2.4.1 信号肽及其选择
• 2.4.2 外源蛋白的糖基化作用
• 2.5 提高外源蛋白表达量的策略
• 2.5.1 优化基因内部结构
• 2.5.2 分泌信号的改造
• 2.5.3 选择高表达的启动子
• 2.5.4 筛选高拷贝转化子
• 2.5.5 优化表达条件
• 2.5.5.1 提高菌株的生物量
• 2.5.5.2 降低外源蛋白的降解
• 2.6 应用前景及局限性
• 3 本研究的目的与意义
• 4 实验技术路线
• 5 酵母表达载体 bFGF/pGAPZα-A 图谱
• 第二章 材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 分子生物学实验常用酶和试剂盒
• 1.3 分子生物学常用试剂
• 1.4 常用培养基配方
• 1.5 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 引物设计与合成
• 2.2 bFGF 基因的克隆
• 2.2.1 PCR 扩增bFGF 基因（朱平，1992）
• 2.2.2 PCR 扩增产物回收
• 2.3 克隆载体的构建及鉴定（黄培堂，2002；颜子颖，王海林，1998）
• 2.3.1 PCR 回收产物与克隆载体T-easy Vector（pMD19-T Vector）的连接
• 2.3.2 E. coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.3.3 连接产物转化感受态细胞
• 2.3.4 质粒制备和纯化（文中所有质粒操作均按以下方法）
• 2.3.5 重组质粒的鉴定
• 2.3.6 bFGF 基因的序列测定
• 2.4 表达载体的构建及鉴定
• 2.4.1 hu-bFGF 基因的制备
• 2.4.2 表达载体pGAPZα-A 的制备
• 2.4.3 bFGF 基因与表达载体的连接
• 2.4.4 连接产物的转化及鉴定
• 2.4.5 bFGF 基因的序列测定
• 2.5 工程菌GS115/pGAPZα-A/hu-bFGF 的构建与筛选
• 2.5.1 pGAPZα-A/hu-bFGF 质粒的制备
• 2.5.2 电转化法酵母GS115 感受态细胞的制备
• 2.5.3 电转化
• 2.5.4 重组菌株PCR 鉴定
• 2.6 酵母的诱导表达
• 2.7 SDS-PAGE 电泳检测和筛选
• 2.7.1 发酵上清液处理
• 2.7.2 发酵产物SDS-PAGE 电泳（汪家政，范明，2002）
• 2.7.3 SDS-PAGE 凝胶进行扫描
• 2.8 Zeocin 高抗性转化子的筛选
• 2.9 发酵条件的优化
• 2.9.1 最适发酵培养基种类
• 2.9.2 最适发酵时间
• 2.9.3 最佳培养基配方
• 2.9.4 最适初始pH
• 2.9.5 最适接种量
• 2.9.6 最适装液量
• 2.10 发酵上清液中蛋白含量的测定
• 2.10.1 总蛋白含量的测定
• 2.10.2 各优化条件对hu-bFGF 表达的SDS-PAGE 分析
• 2.10.3 重组蛋白净含量测定方法
• 2.11 Western blot 分析
• 第三章 结果与分析
• 1 bFGF 基因的克隆、鉴定和测序
• 1.1 bFGF 基因的PCR 扩增
• 1.2 克隆载体pMD19-T/hu-bFGF 的构建与鉴定
• 1.3 表达载体pGAPZα-A/hu-bFGF 的构建与鉴定
• 2 酵母的转化和重组酵母的PCR 鉴定
• 3 Zeocin 高抗性转化子的筛选与鉴定
• 3.1 Zeocin 高抗性转化子的筛选
• 3.2 Zeocin 高抗性转化子摇瓶表达hu-bFGF
• 4 工程菌发酵条件的优化
• 4.1 最适发酵培养基种类
• 4.2 最适发酵时间
• 4.3 最佳培养基配方
• 4.3.1 最适碳源
• 4.3.2 最适麦芽糖浓度
• 4.3.2 最适酵母浸出粉浓度
• 4.3.3 最适蛋白胨浓度
• 4.4 最适初始pH
• 4.5 最适接种量
• 4.6 最适装液量
• 5 发酵上清液中蛋白含量的测定
• 6 Western blot 分析
• 第四章 讨论
• 1 bFGF 的临床应用前景和存在问题
• 2 酵母表达系统的优越性
• 3 电转化法
• 4 表达条件的优化
• 5 本研究今后的主要研究任务
• 第五章 结论
• 参考文献
• 缩略语表
• 致谢
• 附图