柑橘绿霉病拮抗菌的分离筛选及其产物特性研究

论文摘要

指状青霉Penicillium digitatum)引起的柑橘绿霉病(Citrus green mold)是柑橘采后贮运过程中最严重的病害之一,病原菌能产生大量易扩散的分生孢子,使病害的传播十分迅速,在生产中造成了严重的损失。为获得对柑橘绿霉病有防治作用的拮抗菌,以指状青霉为指示菌,采用琼脂块对峙培养法从柑橘根系土壤中分离出414株细菌和58株放线菌,其中菌株X33抑菌活性最强。以菌株X33为研究对象进行了深入的研究,其结果如下：(1)根据培养特征观察、显微形态观察和16SrDNA序列分析等方法的鉴定,确定菌株X33为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。目前国内外尚未见有用淡紫灰链霉菌来防治柑橘绿霉病的报道。(2)采用逐步筛选法和单因素试验优化淡紫灰链霉菌X33抑菌活性物质合成和菌体生长的培养基及培养条件。筛选得到的发酵培养基为：可溶性淀粉20.0 g/L,牛肉膏3.0 g/L,蛋白胨5.0g/L,KNO31.0g/L, K2HPO40.5g/L, NaCl 5.0 g/L。试验获得的适宜发酵条件为：30mL/250mL装液量,按9%的接种量接入48h种子液,先在32℃、200r/min培养48h,然后在28℃、180r/min培养24h。(3)对淡紫灰链霉菌X33抑制指状青霉的的作用机理进行了初步研究,表明淡紫灰链霉菌X33产生的抑菌活性物质对指状青霉的菌丝有致畸、溶解的作用,能显著抑制分生孢子梗的生长和分生孢子的产生,延缓分生孢子的萌发。(4)用杯碟法研究淡紫灰链霉菌X33发酵液对细菌、酵母菌抑制作用,用菌丝生长速率法研究淡紫灰链霉菌X33发酵液对植物病原真菌的抑制作用。结果表明其发酵液对供试的3种革兰氏阳性细菌、3种革兰氏阴性细菌、4种酵母菌和7种植物病原真菌均具有显著的抑制效果,其中对白地霉的抑制效果最好,相对抑制率达到了100%。(5)对淡紫灰链霉菌X33发酵液中抑菌活性物质的稳定性及极性进行了研究,结果显示抑菌活性物质具有较好的耐酸碱和耐紫外线能力；但对热敏感,随着处理温度的升高,其抑菌效果逐步减弱,在115℃加热30min后对指状青霉无抑制作用；抑菌活性物质易溶于水和甲醇等强极性溶剂,不溶于正己烷和石油醚等弱极性溶剂。(6)通过对小鼠进行急性经口毒性试验和亚急性经口毒性试验来研究淡紫灰链霉菌X33发酵液的安全性。急性经口毒性试验表明,淡紫灰链霉菌X33发酵液对小鼠的LD50大于10g/kg·bw,说明受试物属于无毒级物质。亚急性经口毒性试验结果表明各组小白鼠生长发育良好,体重、食物利用率以及血常规等指标与对照组之间无显著差异,各组小白鼠组织解剖检查均未见有意义的病变。

论文目录

• 缩略词
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 文献综述
• 1.1 我国柑橘产业的现状
• 1.2 柑橘采后的主要病害
• 1.2.1 柑橘青绿霉病
• 1.2.2 柑橘黑腐病
• 1.2.3 柑橘蒂腐病
• 1.2.4 柑橘炭疽病
• 1.2.5 柑橘酸腐病
• 1.2.6 其他病害
• 1.3 柑橘采后的保鲜措施
• 1.3.1 化学保鲜措施
• 1.3.2 物理保鲜措施
• 1.3.3 生物防治
• 1.4 生物防治的机理
• 1.4.1 分泌拮抗物质
• 1.4.2 竞争营养与空间
• 1.4.3 重寄生作用
• 1.4.4 诱导寄主抗性
• 1.5 生物防治的研究进展
• 1.5.1 拮抗菌应具备的特点
• 1.5.2 拮抗菌研究进展
• 1.6 链霉菌在生物防治中的应用
• 1.7 淡紫灰链霉菌在生物防治中的应用
• 2 研究内容与技术路线
• 2.1 研究内容
• 2.2 技术路线图
• 第二章 柑橘绿霉病拮抗菌的分离与鉴定
• 1 材料
• 1.1 供试菌种
• 1.2 主要培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 拮抗菌株的分离
• 2.1.1 采样
• 2.1.2 土壤稀释液的制备
• 2.1.3 指状青霉孢子悬液的制备
• 2.1.4 分离
• 2.2 指状青霉拮抗菌株的初筛
• 2.2.1 制备生防菌种子液
• 2.2.2 制备含菌琼脂块
• 2.2.3 制备检定平板
• 2.2.4 琼脂块对峙初筛
• 2.3 指状青霉拮抗菌的复筛
• 2.3.1 拮抗菌摇瓶发酵
• 2.3.2 发酵液预处理
• 2.3.3 复筛
• 2.4 菌株X33的显微形态
• 2.4.1 菌株X33的光学显微形态观察
• 2.4.2 菌株X33的扫描电子显微镜观察
• 2.5 菌株X33的培养特征
• 2.6 菌株X33的16SrDNA序列分析
• 2.6.1 菌株X33基因组DNA的抽提
• 2.6.2 PCR特异性扩增
• 2.6.3 凝胶电泳及产物回收
• 2.6.4 菌株X33的16SrDNA序列测定
• 2.6.5 菌株X33的16SrDNA序列分析及系统发育树构建
• 2.7 菌株X33生理生化特性的研究
• 3 结果与分析
• 3.1 指状青霉拮抗菌的分离及初筛
• 3.2 指状青霉拮抗菌的复筛
• 3.3 菌株X33的显微形态观察
• 3.4 菌株X33的培养形态观察
• 3.5 菌株X33的16SrDNA序列分析
• 3.6 菌株X33的生理生化特征
• 4 小结与讨论
• 第三章 淡紫灰链霉菌X33发酵条件的初步研究
• 1 材料
• 1.1 供试菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 种子液的制备
• 2.2 发酵液抑菌效果的测定
• 2.3 菌体生长量的测定
• 2.4 发酵培养基的初步筛选
• 2.5 培养条件对抑菌效果和菌体生长量的影响
• 2.5.1 培养时间对抑菌效果和菌体生长的影响
• 2.5.2 培养温度对抑菌效果和菌体生长的影响
• 2.5.3 装液量对抑菌效果和菌体生长的影响
• 2.5.4 摇床转速对抑菌效果和菌体生长的影响
• 2.5.5 接种量对抑菌效果和菌体生长的影响
• 2.5.6 初始pH对抑菌效果和菌体生长的影响
• 2.5.7 种龄对抑菌效果和菌体生长的影响
• 2.6 验证性试验
• 3 结果与分析
• 3.1 培养基的初步筛选
• 3.2 培养时间对抑菌效果和菌丝体生长量的影响
• 3.3 培养温度对抑菌效果和菌体生长量的影响
• 3.4 装液量对抑菌效果和菌体生长量的影响
• 3.5 摇床转速对抑菌效果和菌体生长量的影响
• 3.6 接种量对抑菌效果和菌体生长量的影响
• 3.7 初始pH对抑菌效果和菌体生长量的影响
• 3.8 种龄对抑菌效果和菌体生长量的影响
• 3.9 验证性试验
• 4 小结与讨论
• 第四章 抑菌活性物质特性的初步研究
• 1 材料
• 1.1 供试菌种
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 对指状青霉抑菌机理初探
• 2.1.1 对指状青霉菌丝的生长的影响
• 2.1.2 对指状青霉孢子萌发的影响
• 2.2 抗菌谱研究
• 2.2.1 发酵液对细菌的抑制作用
• 2.2.2 发酵液对酵母的抑制作用
• 2.2.3 发酵液对植物病原真菌的抑制作用
• 2.3 活性物质理化特性研究
• 2.3.1 热对活性物质抑菌效果的影响
• 2.3.2 活性物质耐热性的研究
• 2.3.3 紫外线对活性物质抑菌效果的影响
• 2.3.4 pH对活性物质抑菌效果的影响
• 2.3.5 活性物质极性研究
• 3 结果与分析
• 3.0 发酵液对指状青霉菌丝生长的影响
• 3.1 发酵液对指状青霉孢子萌发的影响
• 3.2 发酵液对细菌的抑制作用
• 3.3 发酵液对酵母的抑制作用
• 3.4 发酵液对植物病原真菌的抑制作用
• 3.5 热对发酵液抑菌效果的影响
• 3.6 抑菌活性物质耐热性的研究
• 3.7 紫外线对发酵液抑菌效果的影响
• 3.8 pH对发酵液抑菌效果的影响
• 3.9 抑菌活性物质极性研究
• 4 小结与讨论
• 第五章 发酵液毒理学安全性评价
• 1 研究材料
• 1.1 菌株
• 1.2 受试物
• 1.3 试验动物
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 主要试剂
• 2 研究方法
• 2.1 急性经口毒性试验
• 2.2 亚急性经口毒性试验
• 2.3 发酵液对小鼠食物利用率的影响
• 2.4 发酵液对小鼠血常规指标的影响
• 2.5 发酵液对小鼠主要脏器的影响
• 2.5.1 取材与固定
• 2.5.2 脱水与透明
• 2.5.3 浸蜡包埋与制片
• 2.5.4 HE染色
• 3 结果与分析
• 3.1 急性经口毒性试验
• 3.2 亚急性经口毒性试验
• 3.3 发酵液对小鼠食物利用率的影响
• 3.4 发酵液对小鼠血常规指标的影响
• 3.6 发酵液对小鼠主要脏器的影响
• 4 小结与讨论
• 第六章 结论与展望
• 1 结论
• 1.1 分类鉴定
• 1.2 培养基与培养条件优化
• 1.3 抑菌机理的研究
• 1.4 抗菌谱研究
• 1.5 抑菌活性物质定性研究
• 1.6 抑菌活性物质极性研究
• 1.7 发酵液毒理学安全性研究
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录