无选择标记转高赖氨酸蛋白基因水稻的培育

论文摘要

水稻是一种主要的粮食作物,但其种子蛋白质中赖氨酸的含量偏低,是第一限制性的氨基酸,严重限制人们对其它氨基酸的吸收利用。提高水稻种子中赖氨酸的含量能够有效提高蛋白质的整体利用率,在很大程度上增加稻米的营养价值。因此,高赖氨酸水稻的培育具有重要的意义。转基因技术的发展和新的高赖氨酸蛋白基因的发现使培育优良的高赖氨酸水稻品种成为可能。与此同时,随着转基因植物的商品化生产,其安全性问题也日益引起人们的极大关注,其中选择标记基因的使用是安全性问题的主要来源。基于以上问题,本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法和双T-DNA载体技术,将来源于大豆的高赖氨酸蛋白基因GsHLP2和GsHLP8（赖氨酸重量比分别为18.22%和19.93%）转入水稻,筛选和培育无选择标记基因的转高赖氨酸蛋白基因水稻。取得的主要研究结果如下：1.水稻转化体系优化分别对供试水稻品种、水稻种子的成熟度、灭菌条件、愈伤组织诱导时的培养条件、用于侵染的水稻愈伤及分化时的筛选压力作了优化,结果表明：通育302、空育131和合江19三个水稻品种可以作为水稻遗传转化的材料,并且新鲜成熟的水稻种子更利于愈伤组织的诱导；25%次氯酸钠（NaCIO）20min+0.1%氯化汞（HgCl2）10min的灭菌条件对水稻愈伤诱导良好,而且光照条件下诱导的水稻愈伤在质量和产率上都优于黑暗条件下诱导的愈伤；愈伤继代3-5次较直接转化具有更好的分化率；确定侵染后的水稻愈伤分化阶段筛选时双丙氨膦（Bialaphos）浓度为0.8mg/L。2.遗传转化及T0代转基因植株的获得利用农杆菌介导的遗传转化方法,将5个植物表达载体（pTTBUG2、pTTBUG8、 pTTBGG2、pTTBGG8、pTTBUP2G2）导入供试水稻品种空育131、合江19、通育302中,共获得转化植株149株。3.T。代转基因植株的筛选和检测对所得的转基因植株进行Basta抗性筛选,在苗期叶片涂抹50mg/L的除草剂（Basta）,结果有124株转化植株表现出一定的抗性。进一步对具有Basta抗性的转化植株进行PCR检测,获得转bar基因水稻88株,其中46株同时带有高赖氨酸蛋白基因,阳性率和共转化率分别为70.1%和52.3%。4.T。代转高赖氨酸蛋白基因水稻种子的氨基酸组成分析对所得的转基因植株的T0代种子的氨基酸组成进行测定,结果表明：在检测的6株转基因植株中,其氨基酸的组成和含量并没有明显提高。在赖氨酸占总氨基酸的百分比中,只有转化植株HJ19*P2G2-23的赖氨酸比对照提高了5.14%。5.T1代转基因植株的筛选和检测将转基因水稻的T1代种子接种于含有5mg/LBialaphos的1/2MS培养基中,30±1℃光照培养,一周后可见部分种子发芽后死亡不能正常生长成植株,而部分转基因水稻种子则表现出明显的Bialaphos抗性。对所得的转基因水稻株系通育302*U2-36的T0种子进行温室栽培,取T1植株的叶片进行PCR检测,共检测16株,获得只含有GsHLP2基因而不含bar基因的植株6株；进一步对PCR阳性植株做RT-PCR检测,结果呈阳性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 转基因研究现状及其产业化
• 1.2.2 水稻转基因研究与应用
• 1.2.3 转高赖氨酸蛋白基因水稻研究进展
• 1.2.4 转基因作物的生物安全性分析
• 1.2.5 无选择标记技术
• 1.3 本论文的主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 水稻遗传转化体系优化
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 农杆菌介导法转化水稻
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 0代植株的筛选和检测'>2.3 转化水稻T₀代植株的筛选和检测
• 0代植株的Basta筛选'>2.3.1 水稻T₀代植株的Basta筛选
• 0代植株的PCR检测'>2.3.2 水稻T₀代植株的PCR检测
• 0代种子的氨基酸组成分析'>2.4 转高赖氨酸蛋白基因水稻T₀代种子的氨基酸组成分析
• 2.4.1 试验材料
• 2.4.2 试验方法
• 1代植株的筛选和检测'>2.5 转高赖氨酸蛋白基因水稻T₁代植株的筛选和检测
• 1代植株的Bialaphos筛选'>2.5.1 T₁代植株的Bialaphos筛选
• 1代植株的PCR检测'>2.5.2 T₁代植株的PCR检测
• 1代植株的RT-PCR检测'>2.5.3 T₁代植株的RT-PCR检测
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻遗传转化体系优化
• 3.1.1 供试水稻品种的确定
• 3.1.2 供试水稻种子成熟度的确定
• 3.1.3 水稻种子灭菌条件优化
• 3.1.4 愈伤组织的培养条件确定
• 3.1.5 继代次数对水稻愈伤分化的影响
• 3.1.6 水稻愈伤分化筛选压力的确定
• 3.2 农杆菌介导法转化水稻
• 0代植株的筛选和检测'>3.3 转化水稻T₀代植株的筛选和检测
• 0代水稻植株的Basta筛选'>3.3.1 T₀代水稻植株的Basta筛选
• 0代水稻植株的PCR检测'>3.3.2 T₀代水稻植株的PCR检测
• 0代种子的氨基酸组成分析'>3.4 转高赖氨酸蛋白基因水稻T₀代种子的氨基酸组成分析
• 1代植株的筛选和检测'>3.5 转高赖氨酸蛋白基因水稻T₁代植株的筛选和检测
• 1代植株的Bialaphos筛选'>3.5.1 T₁代植株的Bialaphos筛选
• 1代植株的PCR检测'>3.5.2 T₁代植株的PCR检测
• 1代植株的RT-PCR检测'>3.5.3 T₁代植株的RT-PCR检测
• 4 讨论
• 4.1 遗传转化体系的优化
• 4.2 农杆菌介导法转化水稻
• 4.3 T。种子的氨基酸组成及含量分析
• 4.4 Ti代种子Bialaphos抗性实验
• 5 结论
• 5.1 水稻转化体系优化
• 5.2 共转化水稻植株的获得
• 5.3 转高赖氨酸蛋白基因水稻种子氨基酸组成分析
• 5.4 无选择标记基因水稻植株的获得
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文