T-2毒素对猪原代肝细胞的毒性效应机制研究

论文摘要

T-2毒素属单端孢霉烯族化合物，是该类毒素中毒性较强的一种，主要由镰刀菌产生。T-2毒素广泛存在于谷物食品中，人类和动物暴露T-2毒素会引发各种疾病，畜禽暴露T-2毒素还可能致动物源食品残留，间接危害人类健康。掌握该化合物的致毒机制对制定抗毒措施非常重要。本论文以不同剂量（0、0.02、0.05、0.1μg/mL）T-2毒素暴露的猪原代肝细胞为实验材料，运用基因芯片杂交和荧光差异双向电泳（2-DDIGE）结合MALDI-TOFMS/MS生物质谱分析技术，分别从基因和蛋白水平研究了T-2毒素对猪原代肝细胞的毒性效应及其机制，得到如下主要结果：1.基因芯片结果显示0.05μg/mLT-2毒素暴露猪原代肝细胞后共有1193个基因产生显著变化，包括562个表达上调基因和631个表达下调基因。这些变化的基因涉及氧化还原、免疫反应、转运、蛋白酶解、细胞粘附、脂类代谢、凋亡等多个生物学过程。用Real-time荧光定量PCR验证了参与肝脏外源物质代谢的P450家族基因（CYP3A39、CYP3A46和CYP2C42）以及环氧化物酶EPHX1和羧酸酯酶CES1C4基因，结果上述基因mRNA表达均呈现不同程度的升高，与芯片变化趋势相同，提示这些酶可能参与了T-2毒素的体内转化和代谢过程。2.运用荧光差异双向电泳（2-DDIGE）技术研究0.05μg/mLT-2毒素暴露后猪原代肝细胞蛋白表达谱变化，发现了260个差异蛋白。选择剂量-效应明确，且界限清晰的蛋白点，采用MALDI-TOFMS/MS生物质谱技术进行鉴定，成功鉴定出84差异蛋白，包括34个表达上调蛋白和50个表达下调蛋白。用GeneOntology、KEGG数据库以及PathwayStudioTM（v7.0）软件分析发现它们主要参与蛋白结合、电子传递、信号传导、应激反应、脂类代谢等生物学功能和信号通路。这些蛋白的改变可能与T-2毒素所致肝细胞损伤以及疾病形成过程有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 插图和附表清单
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1 T-2毒素的污染现状与管理
• 2 T-2毒素的生物转化与代谢
• 2.1 生物转化
• 2.2 代谢动力学
• 3 T-2毒素的毒性效应
• 3.1 基因与细胞毒性
• 3.2 血液毒性
• 3.3 消化系统和肝脏毒性
• 3.4 免疫毒性
• 3.5 生殖和发育毒性
• 3.6 其他毒性
• 4.T-2毒素毒性机制的研究方法概述
• 4.1 毒理基因组学
• 4.2 毒理蛋白质组学
• 第二章 引言
• 1 国内外研究现状
• 2 研究目的和意义
• 3 研究内容
• 4 技术路线
• 第三章 暴露T-2毒素对猪原代肝细胞毒性效应的基因组学分析
• 1 材料和方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 猪原代肝细胞的分离与培养
• 1.3 实验处理
• 1.4 总RNA的提取与纯化
• 1.5 基因芯片扫描分析
• 1.6 实时荧光定量RT-PCR
• 1.7 WesternBlot（WB）蛋白印迹
• 2 结果
• 2.1 DNA微阵列基因表达谱差异分析
• 2.2 Real-timePCR基因表达差异分析
• 2.3 WesternBlot蛋白表达差异分析
• 3.小结与讨论
• 第四章 暴露T-2毒素对猪原代肝细胞毒性效应的蛋白质组学分析
• 1 材料和方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 细胞培养
• 1.3 实验处理
• 1.4 样品制备
• 1.5 双向凝胶电泳
• 1.6 质谱检测
• 1.7 生物信息学分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 双向凝胶电泳（2-DDIGE）蛋白表达谱差异分析
• 2.2 差异蛋白生物学功能
• 3 小结
• 全文总结
• 1 主要结论
• 2.创新点
• 3.不足与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录A
• 附录B
• 作者简介
• 硕士在读期间发表的论文