论文摘要
动脉粥样硬化（atherosclerosis, As）是一种慢性炎症性病理过程，炎症刺激在动脉粥样硬化的起始、进展以及并发症的产生中起重要作用。核因子-kappa B（NF-κB）是炎症因子产生的关键转录因子。在动脉粥样硬化斑块中可检测到活化的NF-κB，特异性的沉默或抑制NF-κB通路可减轻动脉粥样硬化斑块面积，并减少其并发症。NF-κB促动脉粥样硬化的机制主要是由炎症因子介导，但近期的研究发现NF-κB可促进巨噬细胞脂质蓄积，这为我们认识NF-κB的促动脉粥样硬化机制提供了新的研究方向。固醇调节元件结合蛋白（Sterol-regulatory element binding proteins, SREBPs）是体内胆固醇生物合成和摄取相关基因的关键调节因子。目前已确定的SREBPs异构体有3种：SREBP-1a、1c和2。SREBPs彼此之间存在相关性，但也有差异：SREBP-1a和SREBP-1c易于激活脂肪酸和三酰甘油合成过程中的基因，而SREBP-2易于激活LDL受体基因和多个胆固醇合成所必需的基因。在SREBPs的内含子区域，含有新发现的一类microRNA（smiRNAs），miR-33s。已知miRNAs是一类具有转录后调节活性的单链小分子RNA，已有研究表明miRNAs参与调控脂质代谢及炎症因子表达，介导As的形成。miR-33s的主要靶基因是三磷酸腺苷结合盒A1（ATP binding cassette transporterA1， ABCA1）。由于ABCA1是介导细胞脂质流出的主要膜转运体，抑制其表达后将导致细胞内蓄积大量的脂质，最终形成泡沫细胞。体内实验发现，抑制miR-33s表达，可促进ABCA1表达和胆固醇逆向转运（RCT），并明显减少斑块面积。因此，miR-33s已成为防治As性疾病的重要靶标。然而，体内对miRNAs的调控研究目前还处在起步阶段，miR-33s在体内的受控机制还远未阐明。越来越多的证据显示固有免疫应答与多种疾病包括As密切相关。NOD样受体（NLRs）是细胞内感受微生物或非微生物信号的模式识别受体，NLRs能形成细胞内大的蛋白复合体，称为“炎性体”，包括NLRs、caspase1和ASC。炎性体的作用是形成一个活化caspase1的支架，促进pro-IL-1β和pro-IL-18分别转化为成熟的IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18与As的发展关系密切，在实验性的小鼠中发现，若缺乏IL-1β或IL-18，则明显限制As的发展。然而，炎性体在体内的调控机制还不甚清楚。通过生物信息学分析，我们发现miR-33s宿主基因SREBPs的启动子区存在NF-κB反应元件（κBREs），提示NF-κB可能通过直接结合SREBPs的启动子，进而调控SREBPs和miR-33s的表达。为了探讨SREBPs和miR-33s在NF-κB促As中的可能作用及机制，因此，我们首先在第一部分中观察了NF-κB对巨噬细胞胆固醇流出及炎症因子表达的影响，然后，在第二部分中我们研究了NF-κB对SREBPs和miR-33s表达的作用及机制，并探讨了miR-33s在NF-κB抑制胆固醇流出中的作用，以及SREBPs在NF-κB促炎症因子释放和炎性体表达中的作用，接着，在第三部分中，我们在体内观察了NF-κB-SREBPs途径在As和炎症反应中的作用，最后，在第四部分中，我们观察了具有明显抗炎效应的白桦脂酸（betulinic acid，BA）在体内外对NF-κB-SREBPs途径的影响，并深入探讨了其作用机制。本研究为揭示NF-κB-SREBPs途径在As发生发展中的可能作用和机制提供新的研究思路。第一部分NF-κB对巨噬细胞胆固醇流出及炎症因子表达的影响目的：观察NF-κB对巨噬细胞胆固醇流出及相关转运体ABCA1的影响，并观察NF-κB对炎症因子表达的影响。方法：培养THP-1细胞株，用160nmol/L的佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate，PMA）刺激细胞24h，使其诱导分化为巨噬细胞。以100μg/ml的氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，oxLDL）分别孵育THP-1和RAW264.7巨噬细胞，使其转化为泡沫细胞。两种细胞分别分为3组：对照组，LPS组（10ng/ml，24h）和LPS+PDTC组（LPS10ng/ml，PDTC50μM，24h）。以液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇的流出，荧光定量PCR检测ABCA1的mRNA表达，Western blotting免疫印迹法检测ABCA1的蛋白表达，酶联免疫吸附法（ELISA）法检测肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、和IL-6的表达。结果：用LPS处理THP-1和RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞后，载脂蛋白A1（apolipoproteinA-I, apoA-I）介导的胆固醇流出明显减少；相应的，ABCA1mRNA和蛋白含量明显下降。使用NF-κB特异性的抑制剂PDTC处理巨噬细胞，可明显减少LPS所致的胆固醇流出下降，并减弱LPS所致的ABCA1表达下降。此外，PDTC处理可明显抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。结论：①NF-κB可抑制巨噬细胞胆固醇流出，下调ABCA1表达；②NF-κB可促进TNFα、IL-6和IL-1β等炎症因子产生。第二部分SREBPs介导NF-κB调控胆固醇流出和炎症因子表达的机制目的：探讨NF-κB调控巨噬细胞胆固醇流出和炎症因子表达的可能分子机制。方法：培养THP-1细胞株，以PMA和ox-LDL建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型。10ng/ml LPS处理3h后，加入放线菌素D（actinomycin D,Act D）（5μg/ml）终止转录，采用定量PCR检测ABCA1mRNA的表达，观察ABCA1mRNA稳定性变化。以LPS处理细胞，观察NF-κB对miR-33s及其宿主基因SREBPs表达影响的浓度效应和时间效应。PDTC处理，观察抑制NF-κB对miR-33s/SREBPs的表达变化。制备SREBPs启动子报告基因质粒，与表达载体p50（pRSV-NF-κB-1）和p65（pRSV-RelA）共同转染HEK-293T细胞，采用双荧光素酶报告基因分析NF-κB对SREBPs启动子的激活作用。染色体免疫共沉淀（ChIP）检测NF-κB是否可直接结合在SREBPs的启动子上。用miR-33a/b mimic（40nM）增加miR-33s的表达，用拮抗剂anti-miR-33a/b（60nM）降低miR-33s的表达，检测ABCA1表达以及细胞胆固醇的流出情况，判断miR-33s在其中的作用。用SREBPs siRNA处理巨噬细胞，研究SREBPs在炎症因子表达中的作用。结果：NF-κB活化后，ABCA1mRNA的降解速度明显加快，NF-κB可增加细胞SREBP-2/miR-33a和SREBP-1a/miR-33b mRNA的表达，以及SREBPs蛋白水平。转染NF-κB后，SREBPs启动子荧光素酶报告基因值明显升高，而κBRE突变后，NF-κB对SREBPs启动子的作用消除。ChIP检测进一步证明了NF-κB可直接结合到SREBPs启动子上。LPS活化NF-κB后，再加入miR-33a/b mimic，ABCA1表达进一步下降，相反，加入anti-miR-33a/b后，NF-κB对ABCA1的抑制作用得到有效缓解。相应的，加入miR-33a/b mimic后，胆固醇流出明显下降，而加入anti-miR-33a/b后，胆固醇流出得以部分恢复。SREBP-2或SREBP-1抑制后，明显降低LPS诱导的IL-1β上调，但对TNF-α、IL-6和IL-18的表达无明显影响。炎性体检测发现，抑制SREBPs后，NLRP1表达下降，而NLRP3无明显影响。进一步使用siRNA抑制NLRP1的表达，发现NF-κB对IL-1β的诱导作用明显下降。结论：①SREBPs是NF-κB的直接靶基因；②NF-κB通过促进miR-33s表达调控ABCA1及胆固醇流出；③NF-κB通过促进SREBPs表达调控NLRP1炎性体及IL-1β产生。第三部分NF-κB对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变及体内炎症因子表达水平的影响目的：以apoE基因敲除（apoE-KO）小鼠为研究对象，观察NF-κB对体内动脉粥样硬化病变、胆固醇逆向转运（RCT）、炎症及NF-κB-SREBPs途径相关分子的表达变化。方法：8周龄雄性apoE-KO小鼠以普通饲料饲养，并随机分为三组：对照组、LPS组和LPS+PDTC组（每组15只）。其中，对照组每周腹腔注射与实验组同等剂量的生理盐水；LPS组每周腹腔注射LPS （2.5mg/kg body wt）1次；LPS+PDTC组每周腹腔注射LPS （2.5mg/kg body wt）和PDTC（50mg/kg body wt）1次。8周后处死动物，采用酶氧化法检测甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）等血脂水平；油红O染色观察主动脉和主动脉窦处脂质蓄积情况；免疫组织化学法检测巨噬细胞标志物CD68和NF-κB的表达；Masson氏染色法检测斑块处胶原纤维面积；ELISA法检测血清炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β和MCP-1等）的表达。液体闪烁计数仪检测小鼠巨噬细胞来源的RCT效率。提取小鼠腹腔巨噬细胞，荧光定量PCR法和western-blot法检测SREBPs、miR-33、ABCA1、ABCG1、NLRPs和NF-κB的表达。结果：与对照组比较，LPS组小鼠血浆TG、TC和LDL-C含量明显增高，而HDL-C则水平降低，加入PDTC后，HDL-C水平有明显回升。PDTC明显减少LPS所致的主动脉窦和主动脉上的As病变面积增加；增加粪便中的胆固醇流出，而肝脏和血液中的胆固醇流出没有明显改变；降低小鼠腹腔巨噬细胞中miR-33表达，促进ABCA1和ABCG1的表达。PDTC处理后，与LPS组比较，巨噬细胞浸润减少而胶原纤维增加；斑块处NF-κB的表达下降；血液中TNF-α、IL-1β和MCP-1等炎症因子表达水平降低；腹腔巨噬细胞中SREBPs和NLRPs的表达下降。结论：①体内NF-κB活化可促进miR-33和SREBPs表达，抑制ABCA1和ABCG1的表达，抑制体内RCT并促进As；②体内NF-κB活化可增加炎症因子水平，并促进NLRPs表达。第四部分白桦脂酸对ABCA1表达和炎症因子释放的影响及机制目的：观察白桦脂酸对ABCA1表达和炎症因子释放的影响并探讨其机制。方法：培养THP-1细胞株，以PMA和ox-LDL建立THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型。以不同浓度（0,0.5,1,2μg/ml）BA处理24h或1μg/ml BA处理不同时间（0,12,24and48h），然后再加入LPS（10ng/ml）作用24h，观察BA预处理对LPS诱导的胆固醇流出和ABCA1表达抑制的影响。高效液相色谱检测细胞内胆固醇含量；荧光定量PCR检测BA处理对miRNA-33s及其宿主基因SREBPs表达的影响；用miR-33a/b mimic增加miR-33s的表达，用拮抗剂anti-miR-33a/b降低miR-33s的表达，检测ABCA1表达情况，判断miR-33s在BA促胆固醇流出中的作用；western-blot法检测NF-κB的核转录水平，使用NF-κB特异性的抑制剂PDTC （50μM）或Bay11-7082（5μM）处理细胞，再加入BA和LPS，荧光定量PCR检测miR-33s和ABCA1的mRNA表达，液体闪烁计数法检测细胞内胆固醇的流出，以明确NF-κB在BA促胆固醇流出中的作用；进一步检测细胞质中IκBα、磷酸化IκBα和细胞核中磷酸化NF-κB p65的表达，以及巨噬细胞炎症因子的分泌情况，以明确BA的抗炎作用及其机制。以apoE基因敲除小鼠为研究对象，观察BA对体内动脉粥样硬化病变和体内炎症反应的影响。结果：BA预处理明显减弱LPS对巨噬细胞胆固醇流出和ABCA1表达的抑制，下调细胞内总胆固醇、胆固醇酯和游离胆固醇的含量。BA预处理有效抑制miR-33s及其宿主基因SREBPs表达。加入anti-miR-33a/b后，与单加LPS组比较，ABCA1的表达明显升高，而加入miR-33a/b mimic，ABCA1的表达则无明显改变；加入BA后，再加入anti-miR-33a/b，ABCA1的表达无明显变化，而加入miR-33a/b mimic，ABCA1的含量明显下降。BA处理可抑制NF-κB的核转录水平； PDTC或Bay11-7082可增强BA对miR-33s的抑制作用，同时增强BA对ABCA1表达及胆固醇流出的促进作用。BA处理后，细胞质中磷酸化IκBα的表达明显下降，细胞核中磷酸化NF-κB p65的表达，炎症因子分泌水平降低。LPS组小鼠较对照组小鼠血浆TG、TC和LDL-C含量明显增高，而HDL-C则水平降低，BA处理后，TG、TC和LDL-C含量下降，HDL-C水平明显回升。组LPS组比较，BA处理组主动脉窦和主动脉上的As病变面积减少；小鼠主动脉miR-33的表达下降；ABCA1表达水平升高；NF-κB的核转录水平下降；血液中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平降低。结论：①BA抗小鼠动脉粥样硬化的作用与其抗炎和降低血脂功能有关；②NF-κB-SREBPs途径参与了BA的抗动脉粥样硬化作用。
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