论文摘要
禽流感病毒是A型流感病毒，可造成禽类全身性感染或主要限于呼吸系统的感染，不仅严重危害养禽业，而且越来越严重地威胁到人类的生存环境，不仅可以直接感染人，并且可以作为人流感病毒的基因库，促使人流感病毒快速的变异。而防控禽流感最有效的措施就是采取免疫接种，但HA和NA基因均具有高的突变率，易造成免疫失败。因此研制一种可以抵抗多种亚型流感病毒的通用疫苗是当务之急。流感病毒基质蛋白2（M2）为流感病毒的外膜蛋白之一，主要以四聚体形式存在于流感病毒粒子表面，作为粒子通道，在流感病毒感染早期和后期通过调控病毒内外的pH值而影响病毒粒子复制。而且其氨基酸序列高度保守，在各个亚型流感病毒间同源性很高。关于人流感病毒M2的研究发现，作为抗原，M2可以诱导产生保护性免疫应答，并具有一定程度的交叉保护力，因此是研究流感通用疫苗的理想抗原。M2主要保护性抗原决定簇在其氨基端的1～24个氨基酸（M2e、），但是M2e仅仅是由24个氨基酸组成，为半抗原，需要一个载体才能成为一个有免疫原性的完全抗原，而且需要一个好的表达系统才能表达出有活性的融合蛋白。因此本文主要从以下几个方面对禽流感病毒M2e的融合表达及融合蛋白的免疫活性进行了研究：1．通过比较H5N1亚型禽流感病毒的M2e序列，人工合成一条M2e 24肽，并偶联至血蓝蛋白（KLH）上，与佐剂乳化后免疫SPF鸡和BALB/c小鼠。分离血清后，以人工合成的24肽作为包被抗原，建立了检测血清中M2特异性抗体的间接ELISA方法，并对间接ELISA方法的实验条件进行了优化，确定了一系列的实验具体参数，此方法的建立为以后的试验奠定了基础。2．根据禽流感病毒H5N1的M2e蛋白氨基酸序列设计两条长互补引物，通过重叠区互补扩增基因法（SOE PCR）扩增出目的基因M2e，然后与鸡IgG Fc片段基因一起克隆入毕赤酵母表达质粒pPICZa-A中，构建表达M2e和Fc融合蛋白的酵母表达载体pPICZaA-M2-Fc。将阳性质粒线性化后电转化入感受态巴斯德毕赤酵母X-33中，通过Zeocin筛选，PCR鉴定出阳性重组子。阳性重组子经甲醇诱导后，通过Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定，证实融合蛋白得到正确表达，并且可以与M2阳性血清反应。3．以非免疫鸡为对象，初步研究了表达的融合蛋白M2e-Fc的免疫学特性。将融合蛋白与佐剂混匀后，免疫非免疫鸡，之后用间接ELISA测定血清中抗M2特异性抗体滴度，并通过中和实验测定抗体的中和指数，间接免疫荧光鉴定抗体与病毒表达M2的亲和力，并将抗体加入培养基中测定抗体对病毒粒子释放的影响。在二免后第四周，测定了非免疫鸡的淋巴细胞，NK细胞和巨噬细胞的活性。结果表明融合蛋白可以刺激机体产生好的体液免疫，而且抗体一定程度上抑制病毒粒子在MDCK细胞上复制，并且IFA证实病毒感染的MDCK细胞表面表达的M2可以与免疫血清特异性结合，但是M2特异性抗体不能中和禽流感病毒感染细胞。而免疫融合蛋白对鸡的细胞免疫没有显著影响。