东北野猪成纤维细胞冷应激应答分子机制研究

论文摘要

野猪是“受国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物之一”。东北野猪属亚洲野猪东北亚种,主要分布在大兴安岭、小兴安岭、张广才岭、老爷岭、完达山、长白山,辽宁的东部横仁、宽甸等地,该区域冬季漫长、寒冷,最低气温可达-40.4℃。相对于家猪而言,东北野猪具有抗逆性高、抗病性强、食性广泛、对于自然界恶劣气候尤其是寒冷环境具有极强的耐受能力。目前国内外关于低温环境对野生动物影响的研究鲜有报道,更多是集中在对模式生物以及畜禽上的研究。研究内容大都集中于血液生化指标、激素和外周血液淋巴细胞热休克蛋白70（heat shock protein70, HSP70）的表达变化等方面,而在细胞水平上进行相关分子机制的研究报道并不多。细胞分子水平的变化是机体各种生理反应的基础,对细胞冷应激相关基因的研究有助于深入理解冷应激对机体影响的生物学机制。野猪是家猪的祖先,遗传基础与家猪相似,但未受到人工选择,其现有性状表型均是受自然选择的结果,因此,以野猪为实验材料,在细胞水平上研究低温环境对其机体影响的分子机制将更接近真实、客观的作用机理。本项目的研究结果将为今后更好的保护与利用野猪资源提供理论帮助。本研究首先构建东北野猪成纤维细胞培养体系,对细胞进行冷应激处理,对重要的冷应激蛋白冷诱导RNA结合蛋白进行克隆和分析,在此基础上,应用流式细胞术、RT-PCR和real-time PCR等实验技术,进一步研究冷应激对细胞周期、细胞凋亡及冷应激相关基因表达的影响及作用机理。从细胞分子水平研究东北野猪的抗寒冷机制,为研究冷应激分子机制建立科学的细胞模型提供理论参考,为体外培养细胞作为试验材料用于揭示机体冷应激分子机制提供了有力佐证,为利用东北野猪在改良家猪抗寒冷应激分子育种提供理论支持。主要研究结果如下：1东北野猪成纤维细胞培养体系的建立及生物学特性研究（1）组织块在贴壁时间为4h,胰酶消化3min,传代细胞贴壁时间为6h条件下,经2次传代便可得到纯化的成纤维细胞,成功建立简单易行的东北野猪成纤维细胞培养体系。（2）建立的东北野猪成纤维细胞系活率高、细胞生长迅速、细胞形态良好、无微生物污染。2冷诱导RNA结合蛋白基因克隆与序列分析从32℃处理的东北野猪成纤维细胞中提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增CIRP的cDNA,构建重组克隆质粒PMD18-T,经PCR、酶切鉴定成功连接后,送测序公司测序。序列分析结果表明：东北野猪CIRP的cDNA被正确克隆,与其他生物CIRP具有较高的同源性。3冷应激对野猪成纤维细胞周期和凋亡的影响（1）持续低温培养抑制东北野猪成纤维细胞的增殖,使细胞产生GO/Gl期阻滞,诱导成纤维细胞凋亡,并随低温强度的增加而作用加强。但随培养时间的延长细胞对低温会产生耐受。（2）低温使复温培养的成纤维细胞产生G2/M期阻滞,同样诱导成纤维细胞凋亡,低温对复温培养细胞凋亡的诱导是一个延迟和渐进的过程,并随低温强度的增加而作用增强。4冷应激对野猪成纤维细胞HSP70、HSP90和CIRP的表达的影响（1）低温培养抑制HSP70mRNA和HSP90mRNA表达,诱导CIRP mRNA的表达,协助细胞获得冷耐受。（2）温和低温（32℃-25℃）诱导复温培养过程中的HSP70和HSP90mRNA表达有所增加,与对照组比差异不显著,但短时诱导CIRP mRNA的表达显著增加,保护细胞降低应激损伤。（3）强度低温（15℃-4℃）强烈诱导复温培养细胞的HSP70mRNA和HSP90mRNA表达,这种表达量的增加与低温强度密切相关,随着处理温度的降低,复温培养HSP70mRNA和HSP90mRNA表达水平升高,且HSP70mRNA的升高程度较HSP90mRNA明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• English Catalog
• 1 绪论
• 1.1 野猪的遗传学研究与开发利用进展
• 1.1.1 野猪的生物学特性
• 1.1.2 野猪与家猪的起源进化关系
• 1.1.3 野猪的开发利用前景
• 1.2 哺乳动物细胞冷应激研究进展
• 1.2.1 冷应激对细胞生物学的影响
• 1.2.2 冷应激对细胞基因表达的影响
• 1.3 课题研究的目的和意义
• 2 东北野猪成纤维细胞分离与培养
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要试剂配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 耳皮肤组织原代培养
• 2.2.2 细胞传代培养
• 2.2.3 细胞冷冻保存
• 2.2.4 细胞的复苏
• 2.2.5 细胞活率检测
• 2.2.6 细胞生长曲线测定
• 2.2.7 细菌、真菌检测
• 2.2.8 支原体检测
• 2.2.9 病毒检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 细胞原代培养
• 2.3.2 原代细胞形态学观察
• 2.3.3 细胞传代培养
• 2.3.4 细胞冻存前及复苏后细胞活率
• 2.3.5 传代细胞生长曲线测定
• 2.3.6 细菌、真菌检测
• 2.3.7 支原体检测
• 2.3.8 病毒检测
• 2.4 讨论
• 2.4.1 实验取材
• 2.4.2 细胞原代和传代培养
• 2.4.3 原代细胞形态观察
• 2.4.4 细胞冷冻保存和复苏
• 2.4.5 细胞微生物污染
• 2.5 本章小结
• 3 冷诱导RNA结合蛋白cDNA的克隆
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验细胞
• 3.1.2 菌种和克隆载体
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 主要溶液试剂配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 细胞冷处理
• 3.2.2 总RNA的提取
• 3.2.3 总RNA检测
• 3.2.4 东北野猪CIRP基因克隆用引物设计
• 3.2.5 cDNA 合成
• 3.2.6 PCR 扩増
• 3.2.7 PCR产物电泳检测
• 3.2.8 感受态细胞的制备
• 3.2.9 目的基因的回收
• 3.2.10 回收片段同T载体旳连接
• 3.2.11 重组质粒的转化
• 3.2.12 转化菌落的PCR鉴定与培养
• 3.2.13 重组质粒的提取
• 3.2.14 重组质粒的双酶切鉴定
• 3.2.15 序列测定及分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 RNA提取结果
• 3.3.2 RT-PCR扩增结果
• 3.3.3 转化质粒的PCR鉴定
• 3.3.4 质粒双酶切鉴定结果
• 3.3.5 序列分析
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 冷应激对细胞周期和细胞凋亡的影响
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 试验细胞
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 细胞低温培养和复温培养
• 4.2.2 细胞周期检测
• 4.2.3 细胞凋亡检测
• 4.2.4 数据分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 低温培养对细胞周期的影响
• 4.3.2 复温培养对细胞周期的影响
• 4.3.3 低温培养对细胞凋亡的影响
• 4.3.4 复温培养对细胞凋亡的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 冷应激对细胞周期的影响
• 4.4.2 冷应激对细胞凋亡的影响
• 4.5 本章小结
• 5 冷应激对成纤维细胞HSP70、HSP90和CIRP mRNA表达的影响
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 实验细胞
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 实验设计
• 5.2.2 总RNA的提取
• 5.2.3 引物设计与合成
• 5.2.4 cDNA合成
• 5.2.5 荧光定量PCR反应
• 5.2.6 PCR产物的分析
• 5.2.7 统计分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 低温培养对HSP70 mRNA表达的影响
• 5.3.2 复温培养对HSP70 mRNA表达的影响
• 5.3.3 低温培养对HSP90 mRNA表达的影响
• 5.3.4 复温培养对HSP90 mRNA表达的影响
• 5.3.5 低温培养对CIRP mRNA表达的影响
• 5.3.6 复温培养对CIRP mRNA表达的影响
• 5.4 讨论
• 5.4.1 冷应激对HSP70和HSP90表达的影响
• 5.4.2 冷应激对CIRP mRNA表达的影响
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢