香蕉炭疽病优势拮抗酵母菌的筛选及鉴定

论文摘要

香焦是重要的热带水果之一,也是世界热带水果中贸易量最大的一种商品。香焦属于呼吸跃变型果实,在后熟过程中，容易受到病原菌的侵染而发生病害,引起果实的大量腐烂,造成较大的经济损失。香蕉炭疽病（Banana anthracnose）是香蕉主要的采后病害,对其进行采后生物防治研究可以有效地控制香蕉采后病害的发生,延长贮藏期限,提高好果率,并确保果品安全卫生,减少经济损失。本实验从8个不同品种香蕉果实上分离纯化酵母菌；然后通过离体（in vitro）筛选和活体（in vivo）筛选的方法,筛选出对香蕉炭疽病有显著抑制作用的优势拮抗酵母菌株；再从形态学特征、生理生化特征和分子生物学特征3个方面鉴定优势拮抗酵母菌的种类。结果如下：1、本实验从8818、红香蕉、粉蕉、大蕉、巴西蕉、皇帝蕉、泰国蕉、芝麻蕉等8个不同品种香蕉的健康果皮表而及炭疽病果病健交界处,共分离纯化329株酵母菌。2、从典型香蕉炭疽病果上分离纯化病原菌,对其进行rDNA-ITS序列分析,得知该病原菌的rDNA-ITS序列全长为575 bp,与香蕉炭疽菌（Colletotrichum musae）有99%的同源性,结合该病原菌的生物学特性及其培养特征,可确定分离的病原菌为香蕉炭疽菌（Colletotrichum musae）。3、对分离的329株酵母菌进行离体筛选,筛选出对香蕉炭疽病原菌拮抗作用最明显的3株酵母菌Z-BR-16、Z-BP-④4和Z-BP-①I2,其抑菌圈半径分别达到4.75 mm、4.63 mm和3.63mm。4、将离体筛选出的对香蕉炭疽病原菌拮抗作用最明显的3株酵母菌进行活体筛选,筛选出拮抗效果最好且稳定的1株拮抗酵母菌Z-BR-16,以无菌水为对照,接种7d后,其1.0×108CFU/ml菌液对香蕉炭疽病的抑制率为75.94%。5、通过形态学特征和生理生化特征鉴定酵母菌Z-BR-16得知：细胞为圆形或椭圆形,多边芽殖,通常有假菌丝,真菌丝少或无,每个子囊中有1-4个帽形或上星形的孢子,成熟时子囊容易破裂而释放出孢子；发酵葡萄糖,不同化硝酸盐,经检索得知该酵母菌为异常毕赤酵母（Pichia anomala）。采用r DNA-ITS序列分析法对酵母菌Z-BR-16进行序列分析,得知该酵母菌的ITS序列全长为617 bp,与异常毕赤酵母（Pichia anomala）的rDNA-ITS序列同源性（Max ident）为100%。结合形态学特征、生理生化特征和rDNA-ITS序列分析3个方面的鉴定结果,得知优势拮抗酵母菌Z-BR-16为异常毕赤酵母（Pichia anomala）。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 香蕉产业

1.2 香蕉采后主要病害种类

1.3 果蔬采后生物防治研究进展

1.3.1 果蔬采后生物防治的应用前景

1.3.2 生物防治在果蔬采后上的应用

1.4 研究目的意义及技术路线

1.4.1 研究目的及意义

1.4.2 技术路线

2 材料与方法

2.1 香蕉果实实验材料

2.2 培养基

2.2.1 常用培养基

2.2.1.1 豆芽汁葡萄糖琼脂培养基

2.2.1.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基

2.2.1.3 葡萄糖-酵母汁-蛋白胨固体培养基

2.2.1.4 酵母增值培养基

2.2.1.5 麦芽汁固体培养基

2.2.2 酵母菌鉴定培养基

2.2.2.1 醋酸盐琼脂培养基

2.2.2.2 Gorodkowa琼脂培养基

2.2.2.3 玉米粉琼脂培养基

2.2.2.4 酵母膏-葡萄糖-蛋白胨培养基

2.2.2.5 McClary培养基

2.2.2.6 糖类发酵培养基

2.2.2.7 碳源同化培养基

2.2.2.8 氮源同化培养基

2.2.2.9 高渗透压培养基

2.2.2.10 LB（Luria-Bertani）培养基

2.3 酵母菌的分离、纯化

2.3.1 样品采集

2.3.2 蕉果附生物的分离

2.3.3 酵母菌的分离、纯化

2.3.3.1 稀释平板法分离酵母单菌落

2.3.3.2 平板划线法分离酵母单菌落

2.3.4 酵母菌种保藏

2.3.4.1 斜而保藏法

2.3.4.2 甘油冷冻保藏法

2.4 病原菌的分离、纯化及保存

2.4.1 病原菌的分离纯化

2.4.2 病原菌保存

2.4.2.1 斜面保藏法

2.4.2.2 甘油冷冻保藏法

2.5 病原菌的鉴定及致病性检测

2.5.1 病原菌的鉴定

2.5.1.1 病原菌的形态学特征鉴定

2.5.1.2 香蕉炭疽病原菌的rDNA-ITS序列分析

2.5.2 病原菌的致病性检测

2.6 拮抗酵母菌的离体（IN VITRO）筛选

2.6.1 酵母菌琼脂块的制备

2.6.2 病原菌孢子悬浮液制备

2.6.2.1 浓度梯度稀释

2.6.2.2 血球计数板法

2.6.3 离体初筛

2.6.4 离体复筛

2.6.4.1 离体复筛Ⅰ

2.6.4.2 离体复筛Ⅱ

2.7 拮抗酵母菌的活体（IN VIVO）筛选

2.7.1 果实消毒

2.7.2 果实分配

2.7.3 果实刺伤

2.7.4 接种菌液

2.8 优势拮抗酵母菌的鉴定

2.8.1 酵母菌的形态学特征观察

2.8.1.1 菌落形态观察

2.8.1.2 细胞形态及液体培养群体特征观察

2.8.1.3 假菌丝的显微镜检

2.8.1.4 掷孢子的显微镜检

2.8.1.5 子囊孢子的显微镜检

2.8.2 酵母菌的生理生化指标测定

2.8.2.1 糖类发酵

2.8.2.2 碳源同化

2.8.2.3 氮源同化

2.8.2.4 高浓度D-葡萄糖生长测试

2.8.2.5 37℃生长测试

2.8.3 酵母茵的rDNA-ITS序列分析

2.9 数据分析

3 结果与分析

3.1 酵母菌的分离纯化结果

3.2 病原菌的鉴定及致病性检测结果

3.2.1 病原菌的形态特征观察结果

3.2.2 病原菌的rDNA-ITS序列分析结果

3.2.3 病原菌的致病性检

3.3 拮抗酵母菌离体（IN VITRO）筛选结果

3.3.1 拮抗酵母菌离体初筛

3.3.2 拮抗酵母菌离体复筛

3.4 拮抗酵母菌活体（IN VIVO）筛选结果

3.4.1 不同浓度酵母菌液对香蕉炭疽病的抑制作用

3.4.2 不同接种时间下酵母菌液对香蕉炭疽病的防治效果

3.4.3 不同酵母菌株对香蕉炭疽病的抑制作用

3.5 优势拮抗酵母菌的鉴定结果

3.5.1 酵母菌形态学特征观察结果

3.5.2 酵母菌生理生化指标测定结果

3.5.2.1 糖类发酵实验结果

3.5.2.2 碳源同化实验结果

3.5.2.3 氮源同化实验结果

3.5.2.4 其他生理生化特征培养结果

3.5.3 酵母菌Z-BR-16的rDNA-ITS序列分析结果

4 讨论

4.1 酵母菌的分离

4.2 关于香蕉炭疽病原菌的分离及鉴定

4.3 关于拮抗酵母菌的筛选

4.4 关于优势拮抗酵母菌的鉴定

4.5 关于下一步研究计划

5 结论

5.1 酵母菌的分离纯化

5.2 香蕉炭疽病原菌分离、鉴定及致病性检测

5.3 离体筛选拮抗酵母菌

5.4 活体筛选拮抗酵母菌

5.5 优势拮抗酵母菌的鉴定

参考文献

附录

附录1 酵母各属检索表

附录2 部分试剂及其配制方法

香蕉炭疽病优势拮抗酵母菌的筛选及鉴定

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