紫云英参与共生固氮的结瘤素基因的分离与鉴定

论文摘要

通过抑制差减杂交，比较了紫云英接种根与不接种根在转录水平上的差异，建立了紫云英共生结瘤过程中的差异表达基因文库。利用斑点杂交对文库进行了初步筛选，选取在接种根中的杂交信号强度高于不接种根至少3倍的克隆进行测序分析。57个cDNA克隆的测序结果表明，17个片段与豆血红蛋白基因（Lb）有着很高的同源性；3个片段分别编码紫云英天冬酰胺合成酶基因AsAS1、AsAS2；7个片段分别与早期结瘤素基因ENOD2、晚期结瘤素基因nodulin-26以及来自田菁（Sesbania rostrata）的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因、羽扇豆（Lupinus luteus）的二磷酸核苷酸磷酸酶1基因、推测的辣椒（Capsicum annuum）半胱氨酸蛋白酶基因、拟南芥（Arabidopsis thaliana）的RNA螺旋酶以及苜蓿（Medicago truncatula）的一个BAC克隆mth2-10i23表现出或多或少的相似性；另外，有30个片段没有找到同源基因。 根据测序分析结果，对其中的16个基因进一步做了Virtual Northern blot验证，杂交结果显示，其中14个基因只在接种根中表达，另外两个，AsD243和AsIB259在未接种根中也有一定表达，但其杂交信号强度远低于接种根。运用RACE法获得了这16个基因的全长cDNA及个别基因的基因组DNA。它们的序列分析表明，11个基因编码的多肽与半胱氨酸簇蛋白（cysteine cluster protein，CCP）家族同源，其序列中均含有信号肽和几个保守的半胱氨酸残基；这11个多肽中，AsG257与防御蛋白2家族同源，AsD255的C-端带有蝎毒素类结构域；基因组DNA序列分析显示，AsD255中编码信号肽的外显子与编码半胱氨酸簇结构域的外显子之间被一个内含子隔开。另外5个基因中，AsE246和AsIB259编码着两个不同的脂类转运蛋白家族（lipid transfer protein，LTP）类似物，序列比对显示，这两个翻译序列与已经报道的豆科植物来源的LTP同源性较低，而与来自非豆科植物的LTP同源性较高；AsD243所编码的20-kD的蛋白质与来自细菌Usp家族（universal stress protein family）的结合ATP的MJ0577型亚家族蛋白高度同源，后者被认为可能具有分子开关的功能；其余两个基因，AsG2511和AsIIC259，前者没有发现明显的同源序列，后者与来自羽扇豆的结瘤素基因LlDD4A9有着一定的相似性。 RT-PCR分析表明，除了AsC2411、AsIB259和AsD243，其它13个基因均只在接种根中表达，在根瘤发育过程中，它们开始转录的时间比紫云英豆血红蛋白基因（Lb）晚2-4天。AsC2411在所有检测的未接种根及幼龄的接种根中有一个基本表达，并在根瘤发育过程中被强烈诱导。AsIB259在接种根不同生长时期的表达情况相似于Lb，它在33天龄的未接种根中也有所表达，但转录水平明显下降。与AsE246相比，AsIB259的表达较早。AsD243在接种和未接种根中均表达，且在成熟根中的转录水平远高于幼根；接种后7天，其表达量显著增加，这比Lb开始表达的时间晚2天。在植物不同组织中的表达分析显示，除了AsD243，其余15个基因均不在叶片和叶柄中表达，它们在根瘤中的转录水平都非常高，其中一些在除去根瘤的接种

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1.前言—文献综述
• 1.1 共生固氮
• 1.1.1 豆科植物与根瘤菌的共生结瘤固氮
• 1.1.2 豆科植物结瘤的遗传学和功能基因组学研究
• 1.1.2.1 植物突变体的研究揭示了结瘤早期信号传导和固氮的分子基础
• 1.1.2.2 功能基因组学的研究揭示了共生双方的代谢交换
• 1.1.3 共生结瘤信号传导分子
• 1.1.3.1 激素类
• 1.1.3.2 多肽
• 1.1.4 百脉根（Lotus japonicus,Lj）和苜蓿的（Medicago truncatula,Mt）的基因组学研究
• 1.1.4.1 Mt的基因组测序
• 1.1.4.2 Lj的基因组测序
• 1.1.4.3 Lj和Mt的重复序列
• 1.1.4.4 和其它豆科植物基因组之间的比较
• 1.1.4.5 Mt与Lj基因组之间的整合
• 1.2 mRNA基础上的差异基因分离方法
• 1.2.1 mRNA差异显示法（mRNA differential display,DDRT-PCR）
• 1.2.2 代表性差异分析（Representational difference analysis,RDA）
• 1.2.3 抑制差减杂交（Suppression subtractive hybridization,SSH）
• 1.2.4 基因表达系列分析（Serial analysis of gene expression,SAGE）
• 1.2.5 基因鉴定集成法（Integrated procedure for gene identification,IPGI）
• 1.2.6 微阵列技术（Microarray）
• 1.3 研究目的和意义
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 转化菌株
• 2.1.3 营养液与培养基配方
• 2.1.4 常用贮存液和缓冲液配方
• 2.1.5 主要分子生物学试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 紫云英总DNA、RNA的提取及mRNA的分离制备
• 2.2.1.1 总DNA的提取
• 2.2.1.2 总RNA的提取与纯化
• 2.2.1.3 mRNA的分离纯化
• 2.2.2 抑制差减杂交
• 2.2.2.1 单链cDNA的合成
• 2.2.2.2 双链cDNA的合成、纯化和浓缩
• 2.2.2.3 酶切消化
• 2.2.2.4 接头连接
• 2.2.2.5 两次差减杂交
• 2.2.2.6 两次PCR扩增
• 2.2.3 差减cDNA文库的构建
• 2.2.4 差示筛选
• 2.2.5 SMART cDNA的合成
• 2.2.6 Virtual Northern blotting
• 2.2.6.1 毛细管法转膜
• 2.2.6.2 探针制备及杂交
• 2.2.7 cDNA末端快速扩增法（RACE）钓取目的基因的全长cDNA
• 2.2.7.1 基因特异性引物（GSP）设计
• 2.2.7.2 RACE-Ready cDNA的合成
• 2.2.7.3 Touchdown PCR扩增cDNA末端（RACE）
• 2.2.7.4 RACE产物的克隆测序及目的基因全长cDNA的获取
• 2.2.8 RT-PCR
• 2.2.9 序列分析
• 2.2.10 统计分析
• 3.结果与分析
• 3.1 抑制差减杂交结果分析
• 3.1.1 接头连接及其效率检测
• 3.1.2 两次PCR扩增结果分析
• 3.2 差减cDNA文库的构建
• 3.3 差示筛选
• 3.3.1 插入片段的扩增
• 3.3.2 斑点杂交的结果
• 3.3.3 核苷酸序列测定与同源性分析
• 3.4 Virtual Northern blotting结果分析
• 3.5 目的基因全长cDNA的克隆及其序列分析
• 3.5.1 编码CCPs（cysteine cluster proteins）同源多肽的基因
• 3.5.2 两个编码植物脂类转运蛋白（lipid transfer proteins,LTPs）同源物的基因
• 3.5.3 一个编码Usp（universal stress protein family）同源蛋白的基因
• 3.6 基因表达分析
• 4.讨论
• 4.1 CCP类蛋白质与植物的防御蛋白家族
• 4.2 两个被首次报道的与根瘤形成有关的LTP类基因
• 4.3 为什么有如此多的抗微生物类蛋白质在根瘤形成中被涉及
• 4.4 AsD243与植物中的细菌Usp家族同源基因
• 参考文献
• 致谢
• 论文发表情况