禽流感（H5N1）病毒耐药性研究

论文摘要

H5N1禽流感病毒在世界各地广泛传播不仅导致大批家禽死亡,造成严重经济损失,而且能引起人类感染,已成为公众健康的严重威胁并可能引发另一个大流感。在有效的H5N1疫苗应用之前,抗流感药物可能是控制H5N1病毒感染人类的有效方法之一,但目前对禽流感（H5N1）病毒的抗药性却了解很少。本研究组对2004-2005年间从越南、泰国和柬埔寨地区分离到的H5N1病毒进行耐药性监测表明,绝大部分分离株具有金刚烷胺类（adamantanes）耐药性突变,但在其它地区（中国,印度尼西亚）较少发现同类抗性变异株。奥斯米韦（oseltamivir）耐药株最初是在越南禽流感（H5N1）病毒感染患者体内发现,但最近的H5N1分离株并未发现已知的神经氨酸酶抑制剂耐药性突变。本实验室研究已经证实2004-2005年间从越南、泰国和柬埔寨分离到的H5N1病毒M2蛋白都存在金刚烷胺耐药性双突变（L26I,S31N）,针对双突变株（26I,31N）为什么能在东南亚地区广泛流行,本研究从细胞水平探讨了双突变耐药株在不同温度下的生长特性。研究结果发现在较高温度（37oC,40oC）培养条件下,带有双突变的H5N1病毒株在MDCK细胞上复制能力比无此突变的敏感株更强,这一特性可能有助于此类H5N1双突变耐药株在体温高于37oC的禽类中广泛传播。此外,中国南方H5N1亚型流感分离株中最常见的烷胺类耐药性突变株（M2-S31N）的比例高于同时期分离到其它亚型（H6N1,H9N2）病毒,我们认为氨基酸突变（S31N）可能在禽流感（H5N1）病毒进化中自然产生,或许与病毒宿主适应性相关。目前仍不清楚从H5N1禽流感患者分离到的奥斯米韦（osletamivir）耐药突变（H274Y）究竟是在药物治疗过程中产生还是禽病毒本身带有。我们分离到一株A/chicken/HongKong/3123.1/2002 （H5N1）变异株（N1-H274Y）,并从细胞水平证实了其对奥斯米韦药物具有耐药性。为了调查在禽源H5N1病毒中是否存在低水平的自然突变耐药株（H274Y）与敏感株混合感染情况,本研究以1997-2005年间从东南亚不同国家不同宿主分离到的311株H5N1分离株为样本,通过建立特异灵敏RT-PCR和荧光定量PCR/LNA进行定性定量分析,并且用不同类型细胞体系研究了奥斯米韦耐药株（N1-274Y）的生长特性。数据显示鸡源中耐药变异（H274Y）混合体存在的比例高于鸭鹅源分离株,但不存在区域性差异。此外,耐药株在哺乳动物细胞和禽类细胞传代结果表明变异株（H274Y）生长特性可能决定于不同宿主的选择性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 第一章 禽流感病毒耐药性研究进展
• 1.1 抗流感病毒药物研究现状
• 1.1.1 M2 蛋白离子通道抑制剂
• 1.1.2 神经氨酸酶（NA）抑制剂
• 1.2 禽流感病毒耐药性研究现状
• 1.2.1 金刚烷胺类药物耐药机制
• 1.2.2 耐药变异株发生频率
• 1.2.3 神经氨酸酶抑制剂耐药性机制
• 1.2.4 耐药变异株（274Y）发生频率
• 1.3 禽流感病毒耐药性检测方法浅析
• 1.4 禽流感病毒耐药性防治对策
• 1.5 研究内容
• 1.6 研究目的及意义
• 试验研究
• 第二章 金刚烷胺类双突变耐药株繁殖特性研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒和细胞
• 2.1.2 主要仪器及耗材
• 2.1.3 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 敏感株双突变体构建
• 2.2.2 重组病毒
• 2.2.3 50% Tissue Culture Infective Dose （TCID50）测定
• 2.2.4 生长特性测定
• 2.2.5 不同亚型禽流感耐药变异株（31N）流行分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 TCID50 测定结果
• 2.3.2 生长特性结果
• 2.3.3 不同亚型禽流感病毒变异株（31N）分析结果
• 2.4 讨论
• 第三章 奥斯米韦耐药变异体（274Y）的筛选及定量
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 病毒cDNA
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 PCR快速检测N1-274Y变异株
• 3.2.2 荧光定量PCR/LNA检测N1-274Y变异株
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 特异PCR快速检测变异株（N1-274Y）结果
• 3.3.2 不同年份鸡禽流感H5N1（274Y）变异株发生频率
• 3.3.3 荧光定量PCR条件的优化及产物鉴定
• 3.3.4 荧光定量PCR标准曲线
• 3.3.5 N1-H274Y荧光定量PCR结果
• 3.4 讨论
• 第四章 H5N1 耐药变异混合体（274Y）生长特性研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 病毒和细胞
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 病毒增殖及传代
• 4.2.2 RNA提取
• 4.2.3 RT-PCR
• 4.2.4 TA克隆
• 4.2.5 测序
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 测序图谱
• 4.3.2 氨基酸序列分析结果
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录1
• 致谢
• 本人简历