三个CTV弱毒分离株的拮抗效果研究

论文摘要

由柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus，CTV）引起的柑橘衰退病是世界范围内最具经济重要性的柑橘病害。应用弱毒系交叉保护（MSCP）是防治茎陷点型柑橘衰退病的有效方法之一。因此，研究CTV弱毒分离株对我国强毒株系的拮抗作用并对其效果进行评价，是筛选具有MSCP应用价值的CTV弱毒分离株的重要环节。本文通过CTV弱毒分离株对强毒分离株的拮抗试验，筛选出拮抗作用强的弱毒株系，可为我国应用MSCP防治柑橘衰退病的打下一定的基础。本文首先对中国农科院柑橘研究所国家柑橘苗木脱毒中心收集的CTV弱毒分离株CT10、CT12、CT17和强毒分离株CT4的p20、p23、p25三个基因RT-PCR产物进行HinfI／RFLP分析，其次对这三个基因测序后进行了酶切位点分析和同源性分析，同时应用四对引物对供试毒源基因组5’基因片段进行RT-PCR分析，以达到区分强、弱毒分离株系的目的。应用上述方法结合茎陷点症状分析，对3个CTV弱毒分离株与强毒分离株CT4之间的拮抗效果进行了评估。此外，还比较了9个保存在新会橙上的CTV分离株嫁接接种到凤凰柚前后p25基因的HinfⅠRFLP和SSCP变化情况。研究结果如下：1)通过酶切发现CTV强毒分离株CT4是以p25 HinfⅠRFLP第Ⅲ组群为主的p25／HinfⅠRFLP第Ⅰ、第Ⅲ组群的混合株系，弱毒分离株CT17与弱毒分离株CT12均属p25／HinfⅠRFLP第Ⅰ组群，弱毒分离株CT10属p25／HinfⅠRFLP第Ⅳ组群。对p20基因的HinfⅠRFLP分析表明，CT10不能被酶切；CT12、CT17的p20／HinfⅠRFLP谱带相同，均有约180bp、约370bp的DNA条带；CT4的酶切谱带具有约100bp、约180bp、约280bp、约370bp的4条DNA条带。2)对供试的4个CTV分离株的p20、p23和p25基因序列同源性分析表明在CT10、CT12和CT17三个弱毒分离株中CT17与强毒分离株CT4同源性最高。3)RT-PCR分析表明用引物T30 5’（f，r）和引物T30 K17（f，r）进行RT-PCR均可将CTV强毒分离株CT4与弱毒分离株CT17、CT12区分开。4)通过本试验所建立的鉴别CTV强、弱毒株系的RFLP方法和其与RT-PCR相结合的方法，实现了对CT4强毒分离株的定期分子监控。5)拮抗实验中对CTV强毒分离株CT4的分子监控表明，接种强毒分离株后1个月、3个月、5个月和8个月，CTV强毒分离株CT4的检出率在经弱毒分离株CT10接种的植株分别为25％、50％、87.5％和100％；在经CT12接种的植株分别为40％、50％、80％和80％；在经CT17接种的植株分别为9.1％、27.3％、35.4％和45.6％。三个CTV弱毒分离株均减少或延迟了强毒分离株CT4的检出，对CT4均表现一定拮抗作用，其中CT17的拮抗效果最好。茎陷点症状的分析结果与分子检测结果一致。6)9个保存在新会橙上的CTV分离株嫁接接种到凤凰柚的p25基因的HinfⅠRFLP和SSCP变化情况的比较试验，结果表明有7个分离株RFLP组群发生变化，其中6个由混合组群变为单一组群；除分离株CT90接种前后的SSCP谱带保持不变外，其余8个分离株从新会橙接种到凤凰柚后，SSCP谱带数均减少。这一现象表明可能某些能在甜橙上增殖的CTV株系在凤凰柚上的增殖受到了抑制。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略符号表
• 第1章 文献综述
• 1.1 柑橘衰退病对我国柑橘产业的威胁
• 1.2 CTV的生物学特征
• 1.2.1 分类地位
• 1.2.2 侵染症状和株系分化
• 1.2.3 寄主与CTV的互作
• 1.2.4 传播途径
• 1.3 CTV的分子生物学特特征
• 1.3.1 CTV病毒粒体和基因组特征
• 1.3.2 CTV复制与表达及致病相关基因研究
• 1.4 柑橘衰退病的防治策略
• 1.5 柑橘衰退病毒的株系鉴定方法
• 1.5.1 指示植物鉴定
• 1.5.2 内含体电镜检测技术
• 1.5.3 血清学检测技术
• 1.5.4 分子生物学鉴定
• 1.6 保护效率和安全性鉴定
• 1.7 小结
• 第2章 引言
• 第3章 CTV分离株的分子特征及拮抗试验分子监控体系建立
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 毒源材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 提取总核酸
• 3.2.2 p25、p23、p20基因的Hinf Ⅰ RFLP分析
• 3.2.3 CTV基因组5’部分基因片段的RT-PCR分析
• 3.2.4 CTV基因组3’部分基因核酸序列测定与分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 p25、p23、p20基因的RT-PCR
• 3.3.2 p25、p23、P20基因的Hinf Ⅰ RFLP分析
• 3.3.3 CTV基因组5’部分基因片断的RT-PCR分析
• 3.3.4 3’部分基因核酸序列测定与分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 不同寄主类型影响CTV株系构成的初步研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 供试毒源
• 4.1.2 供试苗木
• 4.1.3 化学试剂
• 4.1.4 仪器设备
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 CTV毒源的接种
• 4.2.2 直接组织印迹免疫（DTBIA）检测
• 4.2.3 提取总核酸
• 4.2.4 p25基因的RT-PCR
• 4.2.5 p25基因的RT-PCR产物的RFLP分析
• 4.2.6 单链构象多态性（SSCP）分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 DTBIA检测
• 4.3.2 p25基因RT-PCR
• 4.3.3 RFLP分析
• 4.3.4 SSCP分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第5章 拮抗试验
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 CTV分离株毒源
• 5.1.2 供试苗木
• 5.1.3 供试蚜虫
• 5.1.4 试验试剂
• 5.1.5 仪器设备
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 强毒株扩繁及弱毒株免疫接种
• 5.2.2 CTV强毒分离株攻毒接种
• 5.2.3 防效检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 接种CT4后1个月的检测
• 5.3.2 接种CT4后3个月的检测
• 5.3.4 症状观察
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 参考文献
• 附录1 常用缓冲液与储备液
• 附录2 测序峰值图 示例（CT17 p25基因正向测序）
• 附录3 经整理的p25、p23、p20基因序列
• 1、经整理的p25基因序列
• 2、经整理的p23基因序列
• 3、经整理的p20基因序列
• 附录4 p25、p23、p20基因编码的氨基酸序列
• 1、p25基因编码的氨基酸序列
• 2、p23基因编码的氨基酸序列
• 3、p20基因编码的氨基酸序列
• 致谢
• 参与科研项目
• 发表论文情况