论文摘要
乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）是引起病毒性肝炎的主要致病因子。T细胞免疫应答被认为是机体清除HBV感染的主要机制,而T细胞介导的免疫反应也与肝脏的病理损伤密切相关。大量研究表明,急性自限性HBV感染者伴随有高效、多克隆、特异性的CD4+T和CD8+T淋巴细胞反应;而在慢性乙肝患者,这种免疫应答的程度较弱甚至无法检测。抗原递呈细胞是激发机体免疫反应的首要环节,树突状细胞（DC）是已知递呈功能最强的抗原递呈细胞。HBV的免疫清除依赖于HBV特异性T细胞反应的激活,而HBV特异性免疫应答的建立依赖于DC功能的健全。然而,慢性乙肝患者的DC细胞存在功能缺陷。此外,HBV感染人体肝细胞后,在抗原递呈细胞递呈病毒抗原、激活T细胞的过程中,除抗原及MHC-TCR信号外,共刺激信号B7/CD28途径是T细胞活化的第二信号。而B7/CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4）是目前肯定的负性免疫共刺激信号,被认为是维持外周T细胞耐受的一种重要机制,CTLA-4信号的阻断有助于增强抗原特异性的T细胞免疫应答。因此,通过具有较低免疫原性的单链抗体封闭CTLA-4受体进而阻断CTLA-4/B7共抑制通路,联合提高慢性感染者DC功能的策略,可最大程度地增强抗HBV的细胞免疫应答,更为有效地清除HBV的持续感染。HBV转基因小鼠（Transgenic mice,Tg）是一种持续HBV感染模型,包含完整HBV基因组并表达其病毒基因产物,在肝细胞内复制病毒,但肝脏无炎症表现,对HBV病毒抗原耐受且无特异性T细胞应答,是评价打破耐受和结束HBV持续感染的免疫治疗策略的良好实验模型。对HBV Tg鼠的研究发现,HBsAg蛋白或肽冲击的DC疫苗在诱导特异性CTL方面比重组HBsAg或质粒DNA疫苗明显增强,但其作用还不足以抑制HBV DNA复制。另外,本课题组前期研究发现,携带HBsAg基因的重组腺病毒转导的DC比抗原蛋白冲击的DC疫苗能诱导更强的抗病毒CTL应答,但抗体水平和维持作用时间较为有限。因此,还需更有效的免疫策略刺激足够强与足够长时程的免疫应答,以获得更为强大持久的抗病毒免疫效果。本研究通过构建小鼠CTLA-4的单链抗体ScFv,以及ScFv与HBsAg融合表达的重组腺病毒载体Ad-S-ScFv,体外转染小鼠骨髓来源的DC并观察其体外免疫刺激活性。同时,研究和评价该DC疫苗在HBV转基因小鼠中诱导抗HBV免疫的作用特点、分子机制及其对HBV持续感染的可能治疗作用,为该疫苗应用于慢性HBV持续感染的治疗提供实验和理论依据。本研究共分三个部分。第一部分CTLA-4单链抗体ScFv,及HBsAg-ScFv融合表达真核质粒的构建、蛋白纯化与亲合力分析研究目的克隆小鼠CTLA-4单链抗体（ScFv）,构建能稳定表达ScFv及HBsAg-ScFv（S-ScFv）的真核质粒载体,对表达的目的蛋白进行纯化及亲合力测定。研究方法复苏并亚克隆分泌CTLA-4单抗的杂交瘤细胞株4F10并获得高滴度细胞株,反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增该抗体的VH和VL基因,T-A克隆并测序分析。根据VH4F10、VL4F10、（G4S）3基因序列以及载体多克隆位点内切酶的核酸序列设计引物,通过重叠延伸拚接法（splicing by overlap extension,SOE）扩增到ScFv4F10基因,测序核实后分别克隆到pSectag2B空载体和pSectag2B-S中,成功构建真核分泌型表达载体pSect2/ScFv4F10和pSect2/S-ScFv4F10。上述载体转染中华仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞,Western鉴定目的蛋白的表达;成功表达的蛋白经超滤浓缩与亲和层析纯化后,分别通过竞争抑制酶联免疫吸附实验（ELISA）和表面等离子共振（SPR）技术,检测其与重组小鼠CTLA-4抗原的结合活性及亲合常数。研究结果1.成功克隆了CTLA-4的单链抗体ScFv4F10,VL基因全长339bps,VH基因全长345bps,分别编码113和115个氨基酸残基。互联网在线分析结果表明:VL含有明确的4个框架区（FR）和3个抗原决定簇互补区（CDR）,在第23位和第88位为特征性半胱氨酸;VH含有明确的4个框架区和3个抗原决定簇互补区,在第22位和第96位为特征性半胱氨酸。2.成功构建了可稳定表达ScFv4F10和S-ScFv4F10的真核质粒载体,蛋白印迹表明其表达的蛋白分别约28 KDa和52 KDa。3.纯化的ScFv4F10、S-ScFv4F10蛋白均能竞争抑制CTLA-4亲本单抗与重组CTLA-4抗原的结合;亲本单抗、ScFv4F10、S-ScFv4F10与重组CTLA-4抗原的亲合常数KA值分别为7.29×108M-1,9.52×106M-1和2.04×106M-1。研究结论1.成功克隆了小鼠CTLA-4的单链抗体ScFv4F10;2.成功构建了能高效表达ScFv4F10和S-ScFv4F10的真核质粒载体pSect2/ScFv4F10和pSect2/S-ScFv4F10;3.纯化了真核质粒载体pSect2/ScFv4F10、pSect2/S-ScFv转染CHO细胞所分泌表达的目的蛋白,验证了其与CTLA-4抗原具有较高的结合活性。第二部分ScFv,S-ScFv的重组腺病毒载体构建、鉴定与体外活性分析研究目的构建能高效转导ScFv4F10和S-ScFv4F10基因的重组腺病毒,进行病毒扩增和滴度测定,体外感染小鼠骨髓DC并分析其表型及免疫刺激活性。研究方法应用AdEasyTMXL腺病毒载体系统分别构建表达ScFv4F10和S-ScFv4F10的重组腺病毒Ad-ScFv和Ad-S-ScFv。病毒颗粒在AD293细胞中进一步扩增,并用Reed-Muench法测定病毒滴度。流式细胞术分析对照Ad-GFP转染DC的荧光表达效率,Western检测ScFv和S-ScFv在DC中的表达。BALB/c（H-2d）小鼠的骨髓细胞体外与GM-CSF、IL-4和TNF-α共培养7天,形成小鼠骨髓来源的DC,转染重组腺病毒（Ad-ScFv、Ad-S-ScFv或Ad-S、Ad-lacZ）用于体外实验。流式细胞术分析腺病毒转染DC的表型和吞噬抗原能力,ELISA分析IL-12的分泌水平,同种异体和自体混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC的刺激活性,并以流式细胞术分析自体MLR中增殖T细胞内的细胞因子产量。研究结果1.PCR和测序分析显示,穿梭载体和重组腺病毒质粒均含有完整的ScFv4F10和S-ScFv4F10基因序列。Western鉴定了ScFv、S-ScFv蛋白的正确表达。2.通过Reed-Muench法测定第二代重组腺病毒滴度（TCID 50/mL）,结果Ad-ScFv、Ad-S-ScFv均达108/ml。3.对照Ad-GFP以MOI为100转染小鼠骨髓来源的DC细胞,用流式细胞仪检测转染效率为95.05±3.05（%）,荧光强度（MnX）达215.85±53.05。4.流式细胞术分析表明,DC/Ad-ScFv、DC/Ad-S-ScFv、DC/Ad-S、DC/Ad-lacZ和未处理DC,表面CDllc、DEC-205、MHCⅠ类和Ⅱ类分子、CD80、CD86、CD40、CD54等表达增强,为成熟DC表型,且各组间没有显著性差异。各组r Ad/DC均能一定程度地吞噬OVA卵白蛋白,且均能分泌一定量的IL-12,但各组间没有显著性差异。5.无论是同种异体还是自体MLR,各组DC刺激T细胞增殖的功能没有显著性差异。经DC刺激后,自体MLR中CD3+CD8-Th和CD3+CD8+Tc细胞均以分泌IFN-γ为主,表现为Th1/Tc1型。DC/Ad-S-ScFv组刺激IFN-γ的分泌水平最高,而其余各组DC的这种作用无显著性差异。研究结论1.成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体（Ad-ScFv、Ad-S-ScFv）,且能高效转染DC细胞并有效表达目的蛋白。2.证实Ad-ScFv、Ad-S-ScFv体外转导小鼠骨髓DC后,不影响DC的表型成熟、抗原吞噬和IL-12分泌能力。3.与其余各组DC相比,Ad-S-ScFv转导的DC刺激同种异体和自体T细胞增殖活性的能力相当,但其诱导Th1/Tc1（Ⅰ型）细胞因子应答的作用更为明显。第三部分Ad-S-ScFv修饰的树突状细胞诱导HBV转基因小鼠抗HBV免疫的研究研究目的以Ad-S、Ad-ScFv转导DC（DC/Ad-S、DC/Ad-ScFv）为对照,探讨Ad-S-ScFv转导的DC（DC/Ad-S-ScFv）诱导HBV转基因小鼠抗HBV免疫的作用特点、相关分子机制及其对HBV持续感染的可能治疗作用和应用前景。研究方法DC免疫,1×106DC细胞/50μl/只,Tg鼠尾静脉注射,PBS对照（3只）,未处理DC对照（3只）,DC/Ad-S（10只）,DC/Ad-ScFv（10只）,DC/Ad-S-ScFv（10只）,rAd对照DC/Ad-lacZ（3只）;DNA免疫,100μg/50μl/只,双后肢肌肉多点注射,pcDNA3.1（+）-S（9只）,pcDNA3.1（+）对照（3只）。间隔3周后再相同免疫一次;anti-PD-L1注射组（9只）,五天一次腹腔注射,连续四次。流式细胞术检测免疫后Tg鼠脾脏T细胞内HBsAg特异性IFN-γ+CD8+T细胞的比例,ELISA法检测脾细胞HBsAg特异性IL-2、IFN-γ和IL-10的分泌水平。CFSE掺入法测定脾细胞HBsAg特异性的T细胞增殖与CTL杀伤活性,ELISA检测血清HBsAg、抗-HBs水平,荧光定量PCR检测血清HBV DNA滴度,常规生化法检测血清ALT水平。病理切片常规HE染色分析肝脏及其它多个脏器的炎症情况,免疫组化分析肝组织HBsAg和HBcAg的表达。蛋白印迹检测MAPK与PI3K/Akt两条细胞内信号通路相关蛋白的表达与磷酸化水平。研究结果1.免疫后2周,DC/Ad-S-ScFv组比DC/Ad-S、DC/Ad-ScFv、pcDNA3.1-S及anti-PD-L1组诱导HBsAg特异性CD8+T细胞产生IFN-γ的能力显著增强（p＜0.05或p＜0.01）,且能诱导更强的HBsAg特异性CTL应答（效靶比为10:1、20:1、40:1时,p均＜0.01）。而与其余各组相比,DC/Ad-S组诱导CD8+T细胞产生IFN-γ和HBsAg特异性CTL应答的能力也明显增强（p均＜0.05）。2.免疫后4周,DC/Ad-S-ScFv组比DC/Ad-S、DC/Ad-ScFv、pcDNA3.1-S及anti-PD-L1组诱导HBsAg特异性CD8+T细胞产生IFN-γ,以及CTL应答的能力仍强（p＜0.05或p＜0.01）。而与其余各组相比,DC/Ad-S组诱导产生IFN-γ和HBsAg特异性CTL应答的能力无显著性差异（p均＞0.05）。3.DC/Ad-S-ScFv组免疫后2周和4周,诱导Tc产生IFN-γ能力及CTL反应差异均不明显,但免疫后8周时均明显减弱。而DC/Ad-S免疫后4周与2周时相比,其CTL反应及IFN-γ水平明显减弱（p均＜0.01）,免疫后8周时已处于较低水平,且明显低于此时的DC/Ad-S-ScFv组水平。4.Tg鼠血清HBsAg表达抑制作用最强的为DC/Ad-S-ScFv组,尤其是免疫后4周（2-4-8周平均抑制率分别为29.69%-38.35%-17.76%）。而DC/Ad-S组免疫后4周对HBsAg的抑制已经下降,即存在血清HBsAg水平的回升,pcDNA3.1（+）-S组在免疫后1～4周抑制HBsAg的作用不强但平稳（平均12.05%～14.35%）。5.免疫后2周,DC/Ad-S-ScFv组血清HBV DNA水平迅速下降,且显著低于DC/Ad-S组和pcDNA3.1（+）-S组（p＜0.05,p＜0.01）。免疫后4周,Ad-S-ScFv组血清HBV DNA水平仍较低,且明显低于DC/Ad-S组和pcDNA3.1（+）-S组（p均＜0.01）。各组在免疫后8周的血清HBV DNA水平均有反弹,且各组间比较的差异无统计学意义（p均＞0.05）。6.免疫后2周,DC/Ad-S-ScFv组,pcDNA3.1（+）-S组诱导的抗体分别达（24.55±6.25（mIU/ml））和（30.46±7.88（mIU/ml））,其余各组的抗体水平均较低。除pcDNA3.1（+）-S组外,所有血清（1:2稀释）样本抗体水平在免疫后4周均未达10 mIU/ml以上。7.免疫后2周和4周的各组血清ALT有轻度增高,但组间差异不明显。免疫后2-8周,除DC/Ad-S-ScFv、DC/Ad-S组部分Tg鼠肝实质有较明显的局部炎症浸润外,其余各组的炎症浸润情况多不明显。免疫后第2周和第4周,DC/Ad-S-ScFv组Tg鼠的心肌、胃粘膜、小肠、肾脏及肺组织均未发生自身免疫炎症反应。8.肝脏免疫组化结果表明,未免疫和PBS对照组Tg鼠肝组织HBcAg表达强阳性,DC/Ad-S-ScFv组在免疫后2-8周有8例（8/10）肝脏HBcAg表达弱阳性;DC/Ad-S组有6例（6/10）肝脏HBcAg表达弱阳性;而DC/Ad-ScFv、pcDNA3.1（+）-S、anti-PD-L1注射组和DC对照组分别有3例（3/10）、3例（3/9）、1例（1/9）和1例（1/3）HBcAg表达弱阳性。9.肝脏免疫组化结果表明,未免疫和PBS对照组Tg鼠肝组织HBsAg表达强阳性;DC/Ad-S-ScFv组在免疫后2-8周有7例HBsAg表达弱阳性（7/10）;DC/Ad-S有5例HBsAg表达弱阳性（5/10）;而pcDNA3.1（+）-S、DC/Ad-ScFv和DC对照组分别有3例、2例和1例HBsAg表达弱阳性。10.肝组织蛋白印迹表明,DC/Ad-S-ScFv组的MAPK通路的Erk1/2磷酸化水平明显高于其它各组,而Akt蛋白的磷酸化水平在各组间无显著性差异。研究结论1.DC/Ad-S-ScFv能诱导比DC/Ad-S或DNA疫苗更强的Ⅰ型免疫应答和特异性CTL免疫效应,对HBV Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平和肝脏组织HBcAg和HBsAg的表达有较迅速和明显的抑制作用,且未引起免疫小鼠的自身免疫炎症反应。2.DC/Ad-S-ScFv诱导血清抗-HBs的作用仍不强,但在免疫后2周时明显强于Ad-S转导的DC,且与pcDNA3.1（+）-S质粒疫苗的效果相当。3.DC/Ad-S-ScFv免疫小鼠肝组织蛋白印迹表明,MAPK途径的Erk1/2蛋白磷酸化水平明显增强,提示其进一步激活了TCR下游细胞增殖相关信号通路。4.DC/Ad-S-ScFv的抗HBV作用在免疫后2周即明显增强,至少维持4周以上,且作用效果明显优于Ad-S转导的DC和DNA疫苗,直到免疫后8周时效果才明显减弱。5.DC/Ad-S-ScFv是有良好应用前景的HBV持续感染的治疗性疫苗,结合阻断PD-1/PD-L1共抑制途径可能有助于该疫苗进一步增强抗HBV应答的效应。
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