玉米弯孢霉叶斑病菌Clk1基因的克隆与功能分析

论文摘要

玉米弯孢霉叶斑病是由新月弯孢霉[Curvularia lunata (Wakker) Boed.]引起的在我国玉米产区广泛分布的重要病害,研究该病原真菌致病分子机理对于持续控制该病害的发生具有重要意义。MAPK途径是植物病原真菌接收外界信号、调控致病因子表达的重要信号转导途径。为此,本文以MAPK基因Pmk1为对象,研究该基因调控玉米弯孢霉叶斑病菌致病因子及相关基因表达的特点。首先,成功从玉米弯孢霉叶斑病菌中克隆了与Pmk1基因高度同源的Clk1基因,该基因以单拷贝形式存在,全长1271 bp,包含4个内含子,编码352个氨基酸。为验证该基因的功能,对该基因进行了敲除试验,获得的两个Clk1基因敲除子均具有相似的特征。与野型菌株相比,敲除子表现为:白色气生菌丝多;在培养初期生长速度慢,后期生长速度达到或超过野生型菌株;易受低温抑制;不产生分生孢子;丧失侵染玉米离体叶片能力;可侵染受损的玉米叶片,但侵染速度减缓;细胞壁降解酶(PG、PMG、Cx)和毒素活性明显下降,但在色素性状上没有显著变化。敲除子形成一种类似厚垣孢子结构,推测可能与病菌致病力减弱有关。因此,Clk1基因在玉米弯孢霉叶斑病菌的致病过程中发挥着重要的调控作用,这一结论也再次证实了该MAPK途径在调控植物病原真菌致病性上具有的保守性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略语索引
• 第一章 文献综述
• 1 玉米叶斑病的发生与危害
• 1.1 玉米小斑病
• 1.2 玉米大斑病
• 1.3 玉米弯孢霉叶斑病
• 1.4 叶斑病菌生理分化监测
• 2 玉米叶斑病菌致病机理
• 2.1 侵染过程
• 2.2 致病因子
• 3 植物病原真菌信号转导与致病性
• 3.1 信号转导类型
• 3.2 致病相关信号转导途径
• 4 玉米叶斑病菌信号转导途径的研究进展
• 4.1 玉米小斑病菌
• 4.2 玉米大斑病菌
• 5 科学问题的提出.
• 第二章 玉米弯孢霉叶斑病菌Clk1 基因的克隆
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 Clk1 基因同源片段的克隆
• 2.2 Clk1 基因侧翼序列的克隆
• 2.3 Clk1 基因拷贝数的分析
• 3 结果与分析
• 3.1 Clk1 基因同源片段
• 3.2 Clk1 基因侧翼序列
• 3.3 Clk1 基因的拷贝数
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 玉米弯孢霉叶斑病菌Clk1 基因的敲除
• 1 材料
• 1.1 供试菌株和质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 试验方法
• 2.1 敲除载体构建流程
• 2.2 同源敲除载体的构建
• 2.3 同源重组
• 2.4 敲除子的筛选
• 3 结果与分析
• 3.1 同源敲除载体
• 3.2 转化子
• 3.3 敲除子
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四章 Clk1 基因敲除子生物学性状分析
• 1 材料
• 2 试验方法
• 2.1 菌落形态的观察
• 2.2 生长速度的测定
• 2.3 产孢性状的观测
• 2.4 色素性状的观测
• 2.5 蛋白质组2-DE 分析
• 3 结果与分析
• 3.1 菌落形态
• 3.2 生长速度
• 3.3 产孢性状
• 3.4 色素性状
• 3.5 蛋白图谱
• 4 讨论
• 参考文献
• 第五章 Clk1 基因敲除子致病相关性状分析
• 1 材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 鉴别寄主
• 1.3 培养基
• 1.4 试剂
• 2 试验方法
• 2.1 离体叶片致病性检测
• 2.2 细胞壁降解酶活性测定
• 2.3 毒素提取与活性检测
• 3 结果与分析
• 3.1 对离体叶片致病性
• 3.2 细胞壁降解酶的活性
• 3.3 毒素的产量与致病性
• 4 讨论
• 参考文献
• 第六章 总结与展望
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文