2006-2007年广西狂犬病病毒的检测及N、G基因的测序分析

论文摘要

目的:近年来,广西已经成为我国狂犬病发病数最高的省份,而犬是狂犬病病毒最主要的带毒宿主。调查广西犬中狂犬病病毒的带毒情况,分析其遗传进化特点,为制定合理的疫苗有效控制狂犬病疫情提供科学依据。方法:本研究对2006-2007年采自广西12个市的485份犬脑材料、387份唾液材料,进行RT-PCR检测和小鼠脑内接种分离,并对病毒的核蛋白和糖蛋白基因进行测序,序列用生物软件DNASTAR进行核苷酸和氨基酸同源性比较和遗传进化树分析。结果:一共分离到11株狂犬病病毒,其中脑组织11株,其中有一株从脑组织和唾液均分离到狂犬病病毒。通过生物软件分析,11株狂犬病毒株可以分为两个群,其中Ⅰ群毒株包括GXNND（T）、GXHXB、GXLA11、GXQZD,Ⅱ群毒株包括GXLC9、GXPL、GXLCC、GXYZD、GXLA11、GXNN2、GXPXD。11株病毒N基因核苷酸同源性89.0%-99.9%,氨基酸同源性97.8%-99.8%。Ⅰ群的N蛋白主要氨基酸位点变异在90、110、332、397位,而Ⅱ群则主要在42位和332位,且两个群在这些位点的变异与同群参考毒株完全一致,具有群的特异性。11株G基因核苷酸同源性在86.9%-99.9%,氨基酸同源性在93.9%-99.8%。G蛋白的氨基酸的变异主要发生在信号肽与成熟肽,其信号肽与成熟肽的变异也具有群的差异性,Ⅰ群主要的变异位点在第-6、-7、96、132、156、436、443、447位;Ⅱ群主要的变异位点在第-4、-5、-15、-18、90、156、168、204、249、253、289、332、382、427、443、463、474、486、487位。这11株的N P主要抗原位点没有发生变异,Ⅰ群磷酸化位点Ser389也没有变化,且Th细胞表位的氨基酸十分保守。这11株的G P蛋白只有37位和319位两个糖基化位点。抗原位点GⅠ、GⅡ、GⅢ仅有Ⅱ群毒株的GⅢ的332位缬氨酸变异为异亮氨酸。从地域分布看,本研究分离的毒株大多来自南宁和柳州,Ⅱ群主要分布在的桂西一带,Ⅰ群主要在桂东地区。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 狂犬病病毒的宿主
• 2 中国狂犬病流行概述
• 2.1 我国狂犬病的分布及流行情况
• 2.2 广西狂犬病分布和流行情况
• 3 狂犬病病毒的分子生物学特性
• 3.1 狂犬病毒基因组结构
• 3.2 狂犬病毒核蛋白的研究进展
• 3.3 狂犬病毒糖蛋白的研究进展
• 4 狂犬病在分子流行病学方面的研究进展
• 5 诊断
• 6 核蛋白与糖蛋白在疫苗研究中的应用
• 6.1 亚单位疫苗
• 6.2 载体疫苗
• 6.3 基因疫苗
• 6.4 植物表达系统疫苗
• 7 目的与意义
• 一 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病料
• 1.1.2 试验动物
• 1.1.3 仪器和试剂
• 1.1.4 试剂的配制
• 1.1.5 感受态细胞的制备
• 1.1.6 比较用的相关毒株的来源
• 1.1.7 引物的设计
• 1.2 方法
• 1.2.1 实验路线
• 1.2.2 犬脑组织材料及唾液材料的处理
• 1.2.3 病毒RNA的提取
• 1.2.4 犬脑组织阳性诊断
• 1.2.5 小白鼠脑内攻毒试验
• 1.2.6 鼠脑组织病毒RNA提取
• 1.2.7 狂犬病病毒N基因的扩增
• 1.2.8 狂犬病病毒G基因的扩增
• 1.2.9 PCR产物胶回收
• 1.2.10 连接
• 1.2.11 转化
• 1.2.12 抽提质粒
• 1.2.13 重组质粒酶切鉴定
• 1.2.14 测序和序列分析
• 二 实验结果
• 2.1 犬脑组织材料和唾液材料RV检测结果
• 2.2 小白鼠脑内接种试验结果
• 2.3 狂犬病毒N基因克隆及序列分析
• 2.3.1 狂犬病毒N基因的扩增
• 2.3.2 对重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.3 N基因序列比对
• 2.3.4 N基因的遗传进化树分析
• 2.3.5 N蛋白氨基酸变异
• 2.3.6 NP主要抗原表位和Th细胞表位的氨基酸比较
• 2.4 狂犬病毒G基因克隆及序列分析
• 2.4.1 狂犬病毒G基因的扩增
• 2.4.2 对重组质粒的酶切鉴定
• 2.4.3 G基因序列比对
• 2.4.4 G基因的遗传进化树分析
• 2.4.5 G蛋白上主要氨基酸的变异
• 2.4.6 糖基化位点的比较
• 2.4.7 GP主要抗原位点的比较
• 三 讨论
• 3.1 样品调查情况分析
• 3.2 N基因的比较分析
• 3.3 G基因的比较分析
• 3.4 我国狂犬病的分布
• 3.5 广西狂犬病的分布特点及原因
• 3.6 我国疫苗选择的分析
• 3.7 应对的策略
• 四 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文