感染牙鲆的豚链球菌的类M蛋白及其抗原性分析

论文摘要

链球菌是引起鱼类疾病的重要病原菌之一,许多养殖和野生品种的鱼类都对链球菌敏感,包括牙鲆、大菱鲆、银鲑、罗非鱼、虹鳟和美国红鱼等三十多种。本论文研究了感染牙鲆的豚链球菌的致病性和类M蛋白等方面的工作。对从患病牙鲆上分离的3株链球菌进行了人工感染实验,生理生化实验鉴定为豚链球菌（Streptococcus iniae）。用该菌免疫兔和大鼠制备抗血清,间接免疫荧光抗体方法检测抗血清的特异性。用热酸法、热碱法和胃蛋白酶消化法提取豚链球菌NUF849的类M蛋白,SDS-PAGE和Western-blot方法分析比较各方法的差异性。而后采用热酸法提取主要两种链球菌的类M蛋白,分析主要类M蛋白的结构组成及其抗原性。将热酸抽提的类M蛋白、弱毒菌株NUF693分别免疫牙鲆,通过对牙鲆的保护率初步探讨链球菌的类M蛋白的抗原性和免疫保护力。具体方法和结果如下:本研究对从患病牙鲆上分离的3株链球菌进行了人工感染实验,结果显示,NUF849为较强毒力的菌株,半致死量LD50为3.7×105CFU/尾,NUF693和NUF701半致死量LD50分别为1.4×107 CFU/尾和4.6×107CFU/尾,为毒力较弱的菌株。三株细菌采用常规生理生化及API系统鉴定,最终判定3株细菌均为豚链球菌（Streptococcus iniae）。用菌株NUF849的全菌免疫新西兰白兔和健康大鼠,发现其能有效刺激新西兰白兔和大鼠产生免疫应答反应,获得抗血清。酶联免疫吸附法（ELISA）测得血清抗体效价分别为1600和800。免疫荧光抗体技术（IFAT）检测表明鼠抗血清与NUF849发生特异性结合,与停乳链球菌发生部分交叉反应,与弧菌属的部分细菌没有交叉。分别用热酸抽提法、碱抽提法和胃蛋白酶消化法分离豚链球菌NUF849的类M蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blot印迹法分析比较三种方法所提类M蛋白的组成和抗原性差异。结果表明,不同方法提取的类M蛋白结构组成和抗原性均不同。热酸抽提法分离制备的类M蛋白得率和纯度都较其它两种方法高,蛋白的抗原性保持较好。采用热酸提取法提取5株豚链球菌NUF633、NUF693、NUF701、NUF812、NUF849和2株停乳链球菌SD、L2的类M蛋白,其SDS-PAGE图谱明显不同,种间差异明显。Western-blot结果显示,兔抗豚链球菌血清可与豚链球菌的两条类M蛋白带结合,分子量分别为60和37kDa;与停乳链球菌的两条类M蛋白带结合,分子量为68和37 kDa。两种链球菌主要类M蛋白组成及其抗原性差异明显。分子量37 kDa的类M蛋白是7株链球菌的共同抗原,有可能作为制备链球菌亚单位疫苗的候选材料。为进一步验证类M蛋白的抗原性和初步探讨其作为亚单位疫苗的可能性,将热酸提取的类M蛋白、弱毒菌株NUF693分别免疫牙鲆,再进行活菌攻毒,结果显示类M蛋白组、NUF693组对牙鲆的保护率分别为60%、30%,说明类M蛋白有一定的免疫保护性,而弱毒菌株的免疫保护力较弱,对链球菌疫苗的研制有一定的参考价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 链球菌特性概述
• 1.2 鱼类链球菌病研究概述
• 2 链球菌对牙鲆的感染及病原菌鉴定
• 2.1 链球菌对牙鲆的感染实验
• 2.2 感染牙鲆的链球菌的鉴定
• 3 感染牙鲆的豚链球菌的抗血清的制备
• 3.1 链球菌抗血清的制备
• 3.2 免疫荧光抗体技术（IFAT）分析抗血清的特异性
• 4 链球菌类M蛋白及其抗原性分析
• 4.1 感染牙鲆的豚链球菌NUF849 的类M 蛋白的提取及其抗原性分析
• 4.2 感染牙鲆的豚链球菌NUF849 与其它链球菌的类M 蛋白及其抗原性分析
• 4.3 感染牙鲆的豚链球菌NUF849类M蛋白牙鲆免疫效果评价
• 小结
• 参考文献
• 附录:试剂配方
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果