论文摘要
泰乐菌素（tylosin）是一种大环内酯类动物专用型抗生素,对大多数革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌等具有良好的抑制作用,对支原体有特效,因此在养殖业中广泛地被用于预防和治疗各种敏感菌引起的疾病,尤其可作为治疗畜禽支原体疾病的首选药物。临床上可采取静脉注射、肌内注射、混饲及混饮等多途径给药。但泰乐菌素消除半衰期短、体内分布广泛、给药频繁、剂量大,因而一定程度上限制了它在疾病治疗中作用的发挥。因此,研制开发泰乐菌素的缓释靶向制剂具有重要的临床意义。脂质体作为药物载体,具有缓释、靶向、无毒、无免疫原性、可生物降解等特点。本研究的目的在于以磷酸泰乐菌素为模型药物,制备其脂质体制剂,以期改变药物在体内的药动学特性,延长作用时间,减少给药次数,提高生物利用度。本研究成果为进一步完善制剂工艺和提高药物的临床疗效提供理论依据和实验参考。本研究首先建立了专属性较强的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定脂质体中磷酸泰乐菌素的含量。色谱条件为：色谱柱：Kromasil C18柱（4.6mm×150mm,5μm）,流动相：0.05mol/LNaClO4（用1mol/L盐酸调节pH值至3.0±0.1）-乙腈（65：35,v/v）,流速：1.0mL/min,柱温：30℃,紫外检测波长：290nm。在该色谱条件下,磷酸泰乐菌素各组分间,及与辅料和溶剂间分离良好,磷酸泰乐菌素在5.0-320.0μg/mL浓度（C）范围内与泰乐菌素A组分峰面积积)呈良好线性关系,回归方程为：A=9890.364C+2431.270（r=0.9999,n=7）,回收率在99.86%-100.06%之间（n=5）,日内和日间RSD均小于2%（n=5）。该方法灵敏度高、重现性好,可有效排除溶剂、辅料等对测定的干扰,从而快速准确地测定药物含量。同时,对分离磷酸泰乐菌素脂质体与游离药物、用于包封率测定的低温高速离心法进行了考察。结果,在4℃、12000r/min、45mmin的离心条件下,两部分达到了很好的分离。游离药物回收率为99.40%-101.40%,RSD小于2%（n=3）。此外,对磷酸泰乐菌素在不同pH值磷酸盐缓冲液中的表观油/水分配系数（lgP）进行了初步测定。结果显示,在一定pH值（3-9）范围内,磷酸泰乐菌素的lgP随着pH值的升高而增大（-1.3-1.3）,表明其在溶液中的存在形式与pH值有关。此项工作为脂质体的处方设计和工艺优化提供了依据。本实验以大豆卵磷脂和胆固醇为载体材料,以包封率为主要指标,考察了薄膜分散法、乙醚注入法、逆相蒸发法、pH梯度法和硫酸铵梯度法制备磷酸泰乐菌素脂质体的可行性,选择其中包封率最高的硫酸铵梯度法做进一步的实验研究。通过单因素试验,考察了硫酸铵梯度法制备脂质体中影响包封率的主要因素,并采用正交试验对磷酸泰乐菌素脂质体的处方和工艺进行了优化,最后得出最佳处方和工艺,即磷脂与胆固醇质量比为4：1,药脂比为1：10,硫酸铵浓度为300mmol/L,孵化温度为50℃,孵化时间为20min,透析时间为6h,体系载药pH值为7.0。按最佳处方工艺制备的磷酸泰乐菌素脂质体,平均包封率为58.15%,载药量为4.32%。本试验分别对按优化的处方工艺制备的磷酸泰乐菌素脂质体的形态、粒径及分布、pH值、体外释放特性、初步物理稳定性及溶血性等药剂学性质进行了考察,以对其质量进行综合评价。结果所制备的脂质体外观为乳白色混悬液,电镜下观察脂质体呈球形或类球形,规则圆整,平均粒径为6.526μm,1～12μm范围内的粒子占总数的90.3%以上,分布均匀,分散性好,低温条件下保存性质较为稳定,体外药物释放具有良好的缓释特性,无细胞溶血性,所有指标均符合脂质体制剂的质量要求。为解决脂质体稳定性问题,本研究制备了磷酸泰乐菌素冻干脂质体。采用冷冻干燥技术,对冻干保护剂种类及用量进行了比较与筛选,确定了最佳冻干处方,并对产品的制剂学性质做了初步评价。结果表明,在有蔗糖和甘露醇（与磷脂质量比为0.5：2：1）同时作冻干保护剂的情况下,可成功获得磷酸泰乐菌素冻干脂质体,产品表面平整、饱满致密、无皱缩,再分散性良好,粒子无聚集,包封率变化小,很大程度上提高了脂质体溶液的储存稳定性。本试验考察了磷酸泰乐菌素脂质体的体外抗菌效果。采用微量稀释法,通过测定磷酸泰乐菌素脂质体和磷酸泰乐菌素溶液对金黄色葡萄球菌（G+）和大肠杆菌（G）的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）,比较两者的体外抗菌作用。结果显示,磷酸泰乐菌素脂质体对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC分别为1μg/mL和4μg/mL,约为溶液的1/4和1/2。MBC分别为4μg/mL和8μg/mL,均约为溶液的1/2。由此说明,磷酸泰乐菌素脂质体的体外抗菌作用较原药有所增强。本研究以HPLC—内标法为定量手段,以家兔和小鼠为实验动物,研究了磷酸泰乐菌素脂质体的体内经时变化规律。实验设立磷酸泰乐菌素水溶液组和磷酸泰乐菌素脂质体组,按5mg/kg.b.w的剂量于家兔耳缘静脉注射给药,测定不同时间点家兔血浆中的药物浓度,研究两种制剂在家兔体内的药动学特征。结果表明,磷酸泰乐菌素水溶液和脂质体在家兔体内的药动学特征均符合权重系数为1/C2的二室模型,药动学方程分别为：C（t）=67.329e-7.806%22.64%-0.290t,C（t）=67.291e-l0.082t+21.032e-0.178t；t1/2α分别为（0.097±0.035）h,（0.071±0.013）h；t1/2β分别为（2.410±0.246）h,（3.909±.0.275）h；AUC（o-48）分别为（93.50±9.173）（mg·h）/L,（134.048±9.034）（mg-h）/L; CLs分别为（0.051±0.009）L/h/kg, （0.036±0.002）L/h/kg;Vc分别为（0.057±0.009）L/kg,（0.057±0.007）L/kg; MRT（0-48）分别为（4.586±0.229）h,（11.436±0.479）h。两组相比,后者t1/2β延长（P<0.05）,AUC和MRT均明显增加（P<0.01）；Vc和CLs均降低。由此证明,将磷酸泰乐菌素制成脂质体,可延长药物在体内的作用时间,具有很好的缓释效果,能一定程度上提高其生物利用度,增强疗效。同时,以10mg/kg.b.w的剂量于小鼠尾静脉注射给药,测定不同时间点小鼠各组织及血浆中的药物浓度,考察两种制剂在小鼠体内的组织分布情况。结果显示,磷酸泰乐菌素脂质体在各器官中的分布发生了较显著的变化。与溶液相比,其在各组织中的药物浓度有所提高,尤其在肺中增加较为明显,且可维持较长时间,消除减慢,说明磷酸泰乐菌素脂质体具有一定的肺靶向性,可提高肺部疾病的治疗指数。本课题研究结果表明,选择脂质体包裹磷酸泰乐菌素,其制备工艺简单,重现性好。制备的脂质体各项指标符合制剂要求,且具较好的缓释效果和肺靶向特性,有利于延长药物作用时间,提高靶部位的药物水平,减少给药次数和剂量,作为泰乐菌素新型的、理想的缓释靶向制剂具有良好的应用开发前景,达到了本课题研究的预期和最终目的。
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