细菌荧光素酶标记的蓝细菌磷酸盐生物传感器的构建

论文摘要

本研究分别以淡水生的集胞蓝细菌(Synechocystis sp.PCC 6803)和鱼腥蓝细菌(Anabaena sp.PCC 7120)为宿主,选取多个可能受磷酸盐诱导的基因启动子作为响应元件,以来源于发光光杆状菌(Photorhabdus luminescens)的荧光素酶基因luxABCDE作为报告基因构建磷酸盐生物传感器,并对其有效性进行了初步验证。以集胞蓝细菌碱性磷酸酶基因的启动子(PphoA)和编码尿素转运蛋白基因的启动子(PurtA)为响应元件,构建了同源重组质粒pSSΩphoL和pSSΩurtL以及对照质粒pSSΩlux,然后转化集胞蓝细菌,经抗性筛选和PCR验证得到同源重组菌株MSphoL和MSurtL,即响应水环境中磷酸盐变化的蓝细菌传感器和特异性检测对照菌株MSL。MSphoL和MSL在BG11缺磷培养基中的生长情况与在BG11中没有差异,MSphoL的生物发光强度在缺磷诱导180 h后达到最大水平(大约10倍本底水平),而对照菌株则没有变化,说明本研究构建的生物传感器(MSphoL)能特异性响应磷酸盐的变化。本研究通过生物信息学分析的方法在鱼腥蓝细菌中找到了一些磷代谢相关基因的同源基因,选取phoA(alr5291)、phoD1(alr4976)、pstS1(all4575)、phnC(all2230)和all2843五个基因的启动子作为响应元件,构建5个同源重组质粒pRAΩpoAL、pRAΩpoDL、pRAΩpstL、pRAΩphnL和pRAΩa43L以及对照质粒pRAΩlux。其中pRAΩpoDL和pRAΩa43L已经构建完成,待进一步转化鱼腥蓝细菌筛选突变体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 生物传感器概述
• 1.1.1 微生物传感器
• 1.1.2 几种报告基因的比较
• 1.2 蓝细菌与磷酸盐生物传感器
• 1.2.1 蓝细菌简介
• 1.2.2 蓝细菌对磷酸盐的应答
• 1.2.3 磷酸盐的生物传感器
• 1.3 实验的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株、质粒和引物
• 2.1.2 培养基及试剂
• 2.1.3 主要的实验仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株和培养条件
• 2.2.2 Synechocystis sp.PCC 6803的转化
• 2.2.3 Anabaena sp.PCC 7120三亲本杂交
• 2.2.4 Synechocystis sp.PCC 6803的总DNA抽提
• 2.2.5 缺磷诱导实验
• 2.2.6 生物发光测量
• 3 结果与分析
• 3.1 集胞蓝细菌生物传感器的构建和验证
• 3.1.1 三个集胞蓝细菌同源重组质粒的构建
• 3.1.2 生物传感器的构建及PCR检验
• 3.2 集胞蓝细菌生物传感器的生物发光性能检测
• 3.2.1 基本发光曲线
• 3.2.2 菌液体积和浓度对生物发光测量的影响
• 3.2.3 生长曲线
• 3.2.4 生物传感器对缺磷信号的响应
• 3.3 鱼腥蓝细菌生物传感器的构建
• 4 小结和讨论
• 5 参考文献
• 6 致谢