鸟氨酸脱羧酶基因与乳腺癌细胞增殖侵袭关系的实验研究

论文摘要

多胺（polyamine）,包括精脒(spermidine（NH2（CH2）4NH（CH2）3NH2）、精胺(spermine（NH2（CH2）3NH-（CH2）4NH（CH2）3NH2）。它们的代谢前体腐胺（putrescine,NH2（CH2）4NH2）,是在细胞增殖与分化中具有多种功能的组织阳离子,腐胺和精脒几乎存在于所有的物种,而精胺在原核生物中较少见。他们对正常细胞的生长和分化具有非常重要的作用。多胺的合成是由鸟氨酸脱羧酶（ODC）催化,从鸟氨酸变为腐胺,在此过程中,鸟氨酸被ODC脱去一个羧基。然后第一个腺苷蛋氨酸被加到腐胺上产生精脒,这一步由精脒合成酶催化。所以,鸟氨酸脱羧酶（ODC）是细胞中控制多胺生成的关键酶,而多胺则是细胞增殖调控的重要因素,对肿瘤的发生发展起重要作用。实验证明,抑制ODC的活性可以减少多胺的生成,从而抑制肿瘤的生长,达到治疗的目的。乳腺癌是妇女最常见的肿瘤,发病率呈逐年增高趋势,已经成为妇女恶性肿瘤死亡的主要病因之一。在过去数十年中,虽然乳腺癌的诊断及治疗已经取得了重大进展,但总体治愈率并没有得到显著提高,肿瘤的复发和转移是治疗失败的主要原因。多胺在乳腺癌组织中有很高的表达浓度。在乳腺癌组织中,多胺的浓度明显的比正常对照组织中浓度高。并且多胺在肿瘤组织中的浓度与乳腺肿瘤的侵袭能力、组织学分级和Ki-67增殖指数有很密切的关系。有人认为ODC可以作为抑制肿瘤增殖、侵袭的靶标,以往的报道中,多见以ODC不可逆抑制剂DFMO（二氟甲基鸟氨酸）抑制ODC活性防治肿瘤的研究,且在体外研究已证实可以抑制肿瘤的增殖,但由于DFMO细胞毒性较大,在临床实验中出现较多的毒副作用,因而其应用前景令人失望。所以,以ODC为靶标,探讨新的治疗方法,已经引起较为广泛的重视。山东大学医学院生物化学与分子生物学研究中心课题研究组已经以ODC为靶标采用反义RNA技术对前列腺癌,大肠癌等进行基因治疗的研究,并取得良好的效果,但采用这种技术对乳腺癌进行基因治疗的研究尚未见报道。因此,我们选择乳腺癌为目标,研究了腺病毒转导的ODE基因的反义RNA对乳腺癌细胞的作用,为进一步研究乳腺癌基因治疗的方法提供理论依据和技术对策。为探讨以ODC为靶标进行反义基因治疗的可行性,本研究首先采用RT-PCR和western blot方法检测乳腺癌癌肿区及癌旁组织中ODC mRNA/蛋白的表达,并分析其与乳腺癌临床分期（TNM分期）的关系。选取MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,BT474等4种乳腺癌细胞系及MCF-10A正常乳腺上皮细胞,western blot比较ODC蛋白的表达。采用免疫细胞化学方法检测ODC在MDA-MB-231乳腺癌细胞中的表达情况,MDA-MB-231细胞同步化后,westernblot检测MDA-MB-231细胞周期中ODC及cyclinD1蛋白的动态表达。然后利用表达人ODC基因第三外显子反义RNA重组腺病毒载体（rAd-ODC/Ex3as）,将ODC反义RNA转入激素非依赖乳腺癌细胞MDA-MB-231中,通过western blot分别检测ODC和cyclinD1蛋白的表达量,MTT细胞增殖实验和软琼脂集落形成实验检测rAd-ODC/Ex3as对细胞生长增殖的作用。流式细胞术检测对细胞周期的影响。然后,通过细胞迁移实验检测转染rAd-ODC/Ex3as后MDA-MB-231细胞侵袭能力的改变。高效液相色谱法检测rAd-ODC/Ex3as处理前后,MDA-MB-231细胞内多胺浓度的变化。在体内实验中,通过建立乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤模型来分析腺病毒rAd-ODC/Ex3as对肿瘤形成过程的作用。现将本研究主要内容简要介绍如下。第一部分:ODC基因在乳腺癌细胞中的表达[方法]采用RT-PCR和western blot方法检测乳腺癌癌肿区及癌旁组织中ODCmRNA和蛋白的表达,并分析其与乳腺癌临床分期（TNM分期）的关系。ODCcDNA上游引物为5’-GCAGGATCCACCATGAA CAACTTTGGTAA-3’,下游引物为5’-GCCGAGATCTCAGAAGAAGAAACTTC-3’,均位于第三外显子,扩增片段为120bp;β-actin cDNA上游引物5’-GCGGATGTCCA CGTCACACT-3’,下游引物为5’-CCACTGGCATGTGA TGGAC-3’,扩增片段为428bp。选取MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435和BT474等4种乳腺癌细胞系及MCF-10A正常乳腺上皮细胞,western blot检测ODC蛋白的表达。免疫细胞化学方法检测ODC在MDA-MB-231乳腺癌细胞中定位表达情况,MDA-MB-231细胞同步化后,western blot检测MDA-MB-231细胞周期中ODC及cyclinD1蛋白动态表达。统计学方法结果以均数±标准差（x±s）表示,利用spss10.0统计软件的t检验、秩相关分析对结果进行统计处理。[结果]1.癌肿组织中ODC mRNA和蛋白的表达水平普遍高于癌旁乳腺组织,且与乳腺癌临床分期有关。2.ER阳性与ER阴性乳腺癌细胞系ODC蛋白表达无明显差异,但ODC蛋白的表达在所有4种乳腺癌细胞系中均明显高于正常乳腺上皮细胞。3.MDA-MB-231细胞中,ODC在静息细胞内表达较弱,主要表达位于细胞质内,而在处于分裂期细胞中,ODC表达明显增强,主要位于细胞核周围。4.细胞周期中,ODC第一个高峰发生在G1期,随后伴随多胺浓度的增高,在G2期有丝分裂前ODC出现第二个高峰。Cyclin D1的表达也呈现周期性的变化。[结论]ODC基因在乳腺癌细胞中表达较正常细胞中明显增高。在整个细胞周期过程中也存在ODC和cyclin D1的动态变化。ODC有可能作为一个乳腺癌的独立预后指标,同时,以ODC为靶标,研究乳腺癌的增殖及侵袭抑制作用,将对乳腺癌的复发和转移的预防及治疗有较为重要的实际意义。第二部分:ODC基因反义RNA对乳腺癌细胞增殖、侵袭抑制作用的体外研究[方法]为研究鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因反义RNA对乳腺癌细胞的生长及侵袭抑制作用,将表达ODC第三外显子反义RNA的重组腺病毒rAd-ODC/Ex3as感染乳腺癌细胞株MDA-MB-231。采用western blot方法检测rAd-ODC/Ex3as对细胞中ODC和cyclin D1的表达抑制作用,流式细胞术检测其对细胞周期的影响。通过MTT法和软琼脂集落形成实验观察其对乳腺癌细胞增殖的影响。并确定合适的感染滴度,细胞迁移实验分析细胞迁移、侵袭能力的改变。最后通过高效液相色谱法检测rAd-ODC/Ex3as处理前后,MDA-MB-231细胞内多胺浓度的变化。[结果]1,以rAd-ODC/Ex3as感染MDA-MB-231细胞,可明显抑制该细胞中的ODC基因蛋白表达,抑制率为48.2%。同时,cyclin D1表达也明显降低,抑制率55%。2,以50 MOI rAd-ODC/Ex3as感染MDA-MB-231细胞,rAd-ODC/Ex3as使细胞周期停滞于G1期,可明显抑制其生长增殖,最大抑制率为60%,软琼脂集落形成实验显示,rAd-ODC/Ex3as感染MDA-MB-231细胞形成集落数量明显减少。3,细胞迁移实验证实rAd-ODC/Ex3as可抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力。4,rAd-ODC/Ex3as感染后,MDA-MB-231细胞内三种多胺,尤其是腐胺的浓度明显降低。[结论]rAd-ODC/Ex3as在体外能有效地干扰ODC基因的表达,降低细胞内多胺的浓度,并使其细胞周期阻滞于G1期,从而抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,并能降低MDA-MB-231细胞的侵袭性,为进一步基因治疗的研究打下基础。第三部分:ODC基因反义RNA对乳腺癌细胞生长抑制作用的体内研究[方法]检测ODC基因反义RNA对已形成肿瘤的作用:收集MDA-MB-231细胞,调节细胞浓度为5×106/100ul,将100ul细胞悬液注射入裸鼠皮下,当肿瘤直径达到5～7mm时,被随机分组,瘤内注射病毒3×109/pfu每5天注射一次,共3次,肿瘤体积每5天测量一次。[结果]重组腺病毒rAd-ODC/Ex3as对已形成的裸鼠乳腺癌移植瘤,能够减缓其生长,治疗后15天rAd-ODC/Ex3as组与其他两组体积比较有统计学意义（P＜0.05）。即治疗后15天后rAd-0DC/Ex3as处理组肿瘤体积增长速度较对照组和空载体组明显减慢。[结论]通过研究重组腺病毒rAd-ODC/Ex3as对移植瘤模型的作用,结果显示ODC反义RNA对乳腺癌细胞增殖有抑制作用,可以使已形成的皮下乳腺肿瘤减缓生长,从而,将对其局部及远处侵袭有一定的抑制作用。摘要全文总结通过RT-PCR和western blot方法分别检测了乳腺癌组织和细胞系的ODC表达,经统计分析显示癌肿组织中ODC的表达水平普遍高于癌旁乳腺组织,且与乳腺癌临床分期有关。4种乳腺癌细胞系ODC蛋白的表达明显高于正常乳腺上皮细胞。ODC基因反义RNA（rAd-ODC/Ex3as）能明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231中ODC基因的表达,从而使细胞内多胺合成降低。流式细胞术显示rAd-ODC/Ex3as使细胞周期停滞于G1期,软琼脂和MTT检测显示,细胞增殖受到明显抑制。细胞迁移实验发现重组腺病毒rAd-ODC/Ex3as能降低MDA-MB-231的侵袭性。在裸鼠皮下移植瘤模型中,ODC反义RNA可抑制乳腺肿瘤的生长。结果表明:rAd-ODC/Ex3as在乳腺癌细胞内可以有效地干扰ODC基因的表达,从而抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,并降低MDA-MB-231细胞的侵袭性和体内肿瘤的形成与生长。提示ODC反义RNA在肿瘤防治中具有一定意义。该文系ODC基因反义RNA防治乳腺肿瘤的初步研究,为进一步探讨乳腺癌特异的基因疗法提供了理论和实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 论文正文
• 前言
• 第一部分:ODC基因在乳腺癌细胞中的表达
• 1,ODC基因mRNA在乳腺癌组织癌肿区、癌旁区中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 2,ODC基因在乳腺癌细胞系及正常乳腺上皮细胞中的蛋白表达
• 材料与方法
• 结果
• 3,ODC蛋白在MDA-MB-231细胞周期中的动态表达及定位
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分:ODC反义RNA表达载体对乳腺癌细胞增殖侵袭抑制的体外研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分:ODC基因反义RNA对乳腺癌细胞生长抑制作用的体内研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表文章
• 英文论文