一、老年性痴呆（阿尔茨海默病）β淀粉样蛋白人源抗体的体外筛选和表达（论文文献综述）
朱晓婷[1]（2021）在《解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究》文中指出选题依据:阿尔茨海默病（AD）致残、致死率高,发病机制复杂,大脑内Aβ异常沉积是AD发生发展的重要病理变化及核心环节,前期研究已证实了解毒益智方具有抑制AD线虫头部Aβ斑块沉积及相关基因表达的作用,随之开展的随机对照临床研究证实解毒益智方应用6个月后MMSE、MoCA、ADL评分变化明显优于口服尼莫地平片的对照组。黄连为解毒益智方中的君药,为该方的主要成分,在本方中发挥“解毒”的重要功效。经查阅国内外文献发现黄连中发挥“解毒”作用的主要物质为黄连多糖（CCP）,因此设计体外细胞实验探究解毒益智方中的君药黄连的主要有效成分CCP对Aβ25-35损伤PC12的保护作用,为“毒损”的病机及“解毒”的治法提供理论依据,为后续研究提供研究基础。因前期开展的研究均是以单基因单细胞的生物为研究对象,不能很好地模拟AD的疾病特点,因此选用APP/PS1双转基因小鼠作为研究对象,该小鼠很好的模拟了中枢神经系统Aβ异常沉积的状态,通过对小鼠的行为学研究及分子生物学研究,进一步评价解毒益智方的治疗作用。目的:通过体外细胞实验探讨基于“补肾益髓、活血化痰解毒”法形成的解毒益智方其中君药的有效成分CCP对Aβ25-35损伤PC12的保护作用。通过行为学、分子生物学等研究手段,对APP/PS1小鼠的认知功能、Aβ沉积、BACE1表达的相关蛋白、基因等方面进行检测和分析,探讨解毒益智方对APP/PS1小鼠的作用机制,为中药治疗AD的推广应用提供可靠的研究证据。方法:1.本研究分别从体外实验、动物实验探究解毒益智方的作用机制。体外实验部分采用MTT还原法、Hoechst33258荧光染色等方法对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤模型进行线粒体活性、细胞活力、细胞凋亡的测定,探究CCP对PC12细胞的保护作用。动物实验部分选用APP/PS1双转基因小鼠为研究对象,随机分为5组,分别是模型组（APP/PS1组）、盐酸多奈哌齐组（Donepezil组）、解毒益智方低剂量组（JDYZFL组）、解毒益智方中剂量组（JDYZFM组）、解毒益智方高剂量组（JDYZFH组）,每组16只小鼠,另选用16只C57小鼠作为正常对照组（Control组）,于每日早晨8:30进行灌胃治疗,各组每日灌胃药物及剂量分别是,正常组和模型组0.5%CMC溶液0.20g·kg-1·d-1;阳性对照组:盐酸多奈哌齐溶液0.30g·kg-1·d-1;解毒益智方高、中、低剂量组药物浓度依次为0.60g·kg-1·d-1,0.3g·kg-1·d-1,0.15g·kg-1·d-1。持续6个月治疗结束。2.以Aβ25-35损伤的PC12细胞为研究对象,通过测定细胞活力、LDH释放率、细胞凋亡率、和线粒体膜电位的水平等评价CCP的神经保护作用。3.通过水迷宫实验,记录解毒益智方对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响。4.通过ELISE及免疫荧光法检测APP/PS1小鼠脑内Aβ水平的变化,观察解毒益智方对APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积的影响。5.采用PCR方法检测脑组织SIRT1、NF-κB、BACE1基因量变化,并进一步采用Western blot方法检测大脑皮层内SIRT1、BACE1、NF-κB蛋白的变化,观察解毒益智方对APP/PS1小鼠脑内AMPK/SIRT1-PPARγ-PGC1α-BACE1转运蛋白通路SIRT1、BACE1、NF-κB的影响。结果:1.通过体外研究观察CCP对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的影响PC12细胞活力测定结果显示:PC12细胞经过浓度为5-50μM的Aβ25–35处理24h后,细胞活力随着Aβ25–35浓度的增加从24%下降至61%。当Aβ25–35在浓度范围为5至50μM时引起PC12细胞中LDH释放增加至对照组的约130-160%。在用不同浓度的CCP（5至200μg/ml）处理PC12细胞24h后,未观察到显着的细胞损失。通过Hoechst33258染色及FCM测定细胞凋亡结果显示:细胞核在荧光显微镜下具有显着的浓缩核和凋亡的细胞形成。与在未处理的PC12细胞中观察到的完整,圆形和相对大的细胞核相比,暴露于50μMAβ25–35 24h的细胞显示出典型的细胞凋亡特征,包括染色质浓缩,核碎裂和凋亡小体的出现。用CCP不同浓度（5,25,50,100,200μg/ml）处理后可有效逆转细胞凋亡,其中100μg/ml效果最明显,FCM分析显示单独暴露于50μMAβ25–35 24h导致58.88±6.12%的凋亡率,这与正常对照组中的7.21±0.82%的值显着不同（P<0.01）。加入100μg/ml的CCP后,细胞凋亡下降至12.51±1.32%。通过JC-1红色荧光与JC-1绿色荧光的比率的变化来检测Aβ诱导的线粒体功能障碍结果显示:当PC12细胞暴露于50μM的Aβ25–35中24h后,与正常对照组相比,显着减弱了JC-1的红色荧光比例,提高了JC-1绿色荧光比例（P<0.01）。用CCP（100μg/ml）预处理Aβ25–35处理的PC12细胞显着抵消了Aβ25–35损伤引起的膜电位损失,JC-1从Aβ25–35处理的PC12细胞中的22.1%变为绿色荧光至84.3%,与正常对照组相近（P>0.05）。通过蛋白质印迹法检测细胞色素C结果显示:经50μMAβ25–35处理PC12细胞24h后细胞色素C在细胞质中的蛋白质表达增加,而预先用CCP（100μg/ml）处理的PC12细胞显着减弱线粒体释放的胞质细胞色素C。2.观察JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响。水迷宫实验结果显示:随着实验天数的后移,各组小鼠潜伏期、路径长度、游泳距离均有所缩短,表明随着训练次数的增加各组小鼠对象限平台的定位记忆能力随之有所提升。与Control组相比,APP/PS1组逃避潜伏期、路径长度、游泳距离均明显延长,差异显着（P<0.01）。首次到达平台的时间明显延长,目标停留次数明显减少,差异显着（P<0.01）。与APP/PS1组相比,Donepezil组、JDYZFL组、JDYZFM组逃避潜伏期、路径长度、游泳距离有所缩短,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。首次到达平台的时间缩短,目标停留次数增多,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Donepezil组相比,JDYZFL组作用与其相当,JDYZFM组略优于Donepezil组,差异有统计学意义（P<0.05）。干预治疗6个月的12月龄小鼠的定位航行实验及空间搜索实验结果优于干预治疗3个月的9月龄小鼠,差异有统计学意义（P<0.05）。3.观察JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ沉积的影响。各组小鼠结果如下:与Control组比较,APP/PS1组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积极数量明显增多,具有极显着统计学意义（P<0.01）。与APP/PS1组相比,JDYZFL组、JDYZFM组及Donepezil组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量不同程度降低,具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。与Donepezil组比较,JDYZFM组大脑皮层内可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。通过免疫荧光法测得小鼠大脑皮层内Aβ表达发现,Control组只产生微量Aβ,而APP/PS1组Aβ表达量明显增高,经过用药干预后,12月龄干预组小鼠可溶性及不可溶性Aβ1-40、Aβ1-42沉积数量较9月龄小鼠明显减少,免疫荧光标记从宏观上可以发现干预组Aβ沉积明显减少,APP/PS1组Aβ沉积明显增多。4.调控BACE1表达的相关因子结果（1）PCR检测结果各组小鼠进行的PCR检测结果显示:与Control组相比,APP/PS1组小鼠大脑皮层内BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量明显增高,SIRT1/GAPDH明显降低,差异有显着统计学意义(（P<0.01）。与APP/PS1组相比,Donepezil组、JDYZFL组及JDYZFM组小鼠海马体内BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量不同程度降低,SIRT1/GAPDH表达含量不同程度增高,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。JDYZFH组在NF-κB/GAPDH表达上无统计学差异。与Donepezil组相比,JDYZFL组及JDYZFM组BACE1/GAPDH、NF-κB/GAPDH表达含量不同程度降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。PCR结果证实药物干预组可通过提高SIRT1mRNA的含量降低NF-κBmRNA、BACE1mRNA的表达,从而抑制Aβ的产生而起到神经保护的作用。各治疗组大脑皮层Aβ的表达均有所降低。连续灌胃6个月的各组小鼠与连续灌胃3个月的小鼠相比,除APP/PS1组及Control组,其他各组SIRT1mRNA的表达均有所提高,NF-κBmRNA、BACE1mRNA的表达均有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）Westorn blot检测结果各组小鼠的Western blot检测结果显示:与Control组相比,APP/PS1组小鼠大脑皮层SIRT1的蛋白表达明显降低,NF-κB、BACE1蛋白表达显着升高（P<0.01）。与APP/PS1相比,Donepezil组、JDYZFL组、JDYZFM组BACE1、NF-κB表达降低,SIRT1蛋白表达增高差异有统计学意义（P<0.05）。与Donepezil比较,JDYZFL组、JDYZFM组NF-κB蛋白表达有所降低,差异有统计学意义（P<0.05）。JDYZFL组SIRT1、BACE1蛋白表达无显着差异,JDYZFM组SIRT1表达有所提高,BACE1蛋白表达量略有降低,差异有统计学意义（P<0.05）。经过为期3个月及6个月的干预后,各治疗组大脑皮层Aβ的表达均有所降低。连续灌胃6个月的各组小鼠与连续灌胃3个月的小鼠相比,除APP/PS1组及Control组,其他各组SIRT1的蛋白表达均有所提高,NF-κB、BACE1蛋白的表达均有所降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1 CCP能够保护Aβ25-35损伤的PC12细胞,其机制可能与提高细胞活力、抑制细胞凋亡、减少LDH释放、阻断膜电位的丧失,并阻止线粒体细胞色素C释放,修复线粒体功能障碍有关。2 JDYZF各剂量组可不同程度提高APP/PS1双转基因小鼠定位航行实验及空间搜索实验的成绩,说明JDYZF可改善小鼠空间学习及记忆能力。3 JDYZF可不同程度降低APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层内Aβ的异常沉积。4 JDYZF抑制BACE1的异常表达,其作用机制可能是通过调控大脑内AMPK/SIRT1-PPARγ-PGC1α-BACE1信号通路的相关因子表达实现的。
高炎[2]（2021）在《黄连解毒汤治疗阿尔茨海默病的临床观察及实验研究》文中进行了进一步梳理目的:阿尔兹海默病（Alzeimer disease,AD）以起病隐匿、进行性认知功能损害为特征,属神经系统变性疾病,给患者生存质量及生命健康带来严重危害,目前我国老龄人口逐渐增加,AD的患病人数也逐年上升,药物治疗可改善AD患者临床症状,但不能彻底阻断其病程发展,服药疗程较长。既往临床研究结果显示,黄连解毒汤对AD具有治疗作用,在实验研究方面,黄连解毒汤对AD模型小鼠具有抑制AD特征性病理改变,下调炎性因子表达等作用效应。本研究采用单中心、随机、阳性药物对照、非劣效性设计,以多奈哌齐为对照药物,通过整体认知功能、日常生活活动能力、生活质量、中医证候方面综合评价黄连解毒汤对AD的疗效,通过观察不同时间点疗效以及不同时间段的疗效维持效应,分析黄连解毒汤治疗AD的时效特征。通过分析中医证候要素与整体认知功能、日常生活活动能力、生活质量的相关性,从现代医学角度理解AD患者中医证候的临床意义。为中医诊疗AD及应用黄连解毒汤治疗AD提供研究依据。本研究从学习记忆能力、Aβ及相关炎性因子、组织病理表现、小胶质细胞活化状态、NLRP3炎性小体相关蛋白及基因表达多层面观察黄连解毒汤对AD模型小鼠的作用效应,探讨黄连解毒汤干预AD的可能性机制。方法:1.临床观察:本研究收集符合纳入标准的50例AD患者,研究过程包含筛选AD患者、基线评价、随机分组、治疗阶段（12周）、随访阶段（12周）。经筛选后的AD患者随机分为试验组和对照组,均进行基线评价,评估可比性。在治疗阶段,对照组用多奈哌齐治疗,试验组用黄连解毒汤治疗。在随访阶段,停用黄连解毒汤和多奈哌齐。在疗效评价的指标方面,主要观察指标为MMSE量表与ADAS-Cog量表的评分以评价整体认知功能,ADL量表评分评价日常生活活动能力,QOL-AD量表评分评价生活质量,次要观察指标为PES-D/11量表评分评价中医证候要素分布及程度。分别比较两组患者主要观察指标在治疗后各时间点（入组第4、8、12、16、20、24周）与治疗前的差异,并分析同一时间点两组患者主要观察指标的组间差异。分析两组患者于入组第12周至第16周、入组第16周至第20周、入组第20周至第24周的主要观察指标差异率,进而比较两组疗效维持效应的差异。通过分析PES-D/11量表评分与MMSE、ADAS-Cog、ADL、QOL-AD量表评分的相关性,探讨中医证候要素与整体认知功能、日常生活活动能力、生活质量的相关性。比较两组患者次要观察指标于入组第12周的组间差异,观察黄连解毒汤与多奈哌齐对中医证候的影响并分析疗效差异。最后对两组服药的安全性以及依从性进行评价。2.实验研究:本实验以9月龄Tau/APP/PS1三转基因的AD模型小鼠为研究对象,随机分为模型组、多奈哌齐组、黄连解毒汤（Huanglian Jiedu Decoction,HLJDT）大剂量组、黄连解毒汤中剂量组、黄连解毒汤小剂量组。模型组予以羧甲基纤维素钠溶液,多奈哌齐组予以盐酸多奈哌齐片溶液,黄连解毒汤大、中、小剂量组分别予以865mg·kg-1·d-1、433mg·kg-1·d-1、216mg·kg-1·d-1不同浓度的黄连解毒汤提取物溶液,均灌胃给药3个月。实验一应用Morris水迷宫实验评价五组小鼠的学习能力与记忆能力。实验二通过ELISA法检测五组小鼠海马组织中可溶性及不可溶性的Aβ 1-40及Aβ 1-42、IL-1 β、IL-18的表达水平。实验三运用HE染色法观察五组小鼠海马CA1区的组织形态改变,用免疫组化方法观察五组小鼠海马CA1区的小胶质细胞形态及活化的小胶质细胞数量。实验四通过免疫印迹法检测五组小鼠海马组织NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Caspase-1 p20的蛋白表达量,采用实时荧光定量PCR检测五组小鼠海马组织NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表达水平。结果:1.临床观察（1）患者招募情况本研究纳入AD患者50例,脱落8例,最终完成研究患者42例,试验组21例,对照组21例。（2）基线资料试验组与对照组患者治疗前在一般资料、痴呆评价相关量表评分、中医证候要素分布及证候程度、神经影像学评分方面,组间无统计学差异（P>0.05）。（3）各时间点疗效指标比较在MMSE量表评分方面,试验组与对照组于入组第4、8、20、24周的评分较治疗前无统计学差异（P>0.05）,两组于入组第12、16周的评分较治疗前增加（P<0.05）,入组第4、8、12、16、20、24周试验组与对照组评分的组间比较均无统计学差异（P>0.05）。在ADAS-Cog量表评分方面,试验组与对照组于入组第4、8、20、24周的评分较治疗前无统计学差异（P>0.05）,两组于入组第12、16周的评分较治疗前降低（P<0.05）,入组第4、8、12、16、20、24周试验组与对照组评分的组间比较均无统计学差异（P>0.05）。在ADL量表评分方面,试验组于入组第4、8、20、24周的评分较治疗前无统计学差异（P>0.05）,对照组于入组第4、8、16、20、24周的评分较治疗前无统计学差异（P>0.05）,试验组于入组第12、16周的评分较治疗前降低（P<0.05）,对照组于入组第12周的评分较治疗前降低（P<0.05）,入组第4、8、12、16、20、24周试验组与对照组评分的组间比较均无统计学差异（P>0.05）。在QOL-AD量表评分方面,试验组于入组第4、20、24周的评分较治疗前无统计学差异（P>0.05）,对照组于入组第4、8、20、24周的评分较治疗前无统计学差异（P>0.05）,试验组于入组第8、12、16周的评分较治疗前评分升高（P<0.05）,对照组于入组第12、16周的评分较治疗前评分升高（P<0.05）,入组第4、8、12、16、20、24周试验组与对照组评分的组间比较均无统计学差异（P>0.05）。重复测量数据的方差分析结果显示时间因素影响两组患者的MMSE、ADAS-Cog、ADL、QOL-AD评分。两组MMSE、QOL-AD评分在时间与组别间不存在交互效应,两组ADAS-Cog、ADL评分在时间与组别间存在交互效应。在MMSE、ADAS-Cog、ADL、QOL-AD评分方面,作为主体内差异因素的各时间点,其评分间有统计学差异（P<0.05）,作为主体间差异因素的两治疗方法,其评分间无统计学差异（P>0.05）。MMSE、QOL-AD评分随两组治疗时间的延长而增加,均在入组第12周升至最高水平。ADAS-cog、ADL评分随两组治疗时间的延长而降低,均在入组第12周降至最低水平。疗程结束后两组MMSE、QOL-AD评分出现降低,ADAS-cog、ADL评分出现升高。（4）疗效的维持效应入组第12周至第16周试验组与对照组ADL、QOL-AD评分差异率的组间比较有统计学差异（P<0.05）,显示试验组的疗效维持效应优于对照组,而同时间段MMSE、ADAS-cog评分差异率的组间比较无统计学差异（P>0.05）;入组第16周至第20周以及入组第20周至第24周试验组与对照组MMSE、ADAS-cog、ADL、QOL-AD评分差异率的组间比较均无统计学差异（P>0.05）。（5）中医证候要素与认知功能、日常生活活动能力、生活质量的相关性Spearman相关系数分析结果显示髓减、毒盛积分与MMSE评分呈负相关（r=-0.31,P=0.04;r=-0.33,P=0.03）,肾虚、毒盛积分与 ADAS-Cog评分呈正相关（r=0.39,P=0.01;r=0.31,P=0.04）。髓减、毒盛积分与ADL 评分呈正相关（r=0.35,P=0.02;r=0.32,P=0.04）。肾虚、痰浊、毒盛积分与QOL-AD评分呈负相关（r=-0.35,P=0.03;r=-0.36,P=0.02;r=-0.32,P=0.04）。（6）黄连解毒汤对中医证候要素的影响与治疗前比较,试验组治疗结束后（入组第12周）阳亢证、火毒证、痰浊证的积分均降低（P<0.05）,对照组治疗结束后（入组第12周）肾虚证、气虚证、血虚证、髓减证、血瘀证、阳亢证、痰浊证、火毒证的积分均无显着改变（P>0.05）。于两组治疗结束后（入组第12周）,试验组阳亢证、火毒证的积分均较对照组降低（P<0.05）,而两组肾虚证、气虚证、血虚证、髓减证、痰浊证、血瘀证积分无统计学差异（P>0.05）。（7）安全性观察两组患者于入组、治疗、随访期间的安全性相关实验室指标均未发生异常。不良反应方面,对照组恶心1例,试验组腹胀2例,均为轻度。两组不良反应发生率无统计学差异（P>0.05）。（8）依从性观察试验组服药依从率为85.71%（18/21）,对照组为80.95%（17/21）,两组服药依从率无统计学差异（P>0.05）。2.实验研究（1）黄连解毒汤对AD模型小鼠学习记忆能力的影响在前4天训练期以及第5天的定位航行实验中,5组小鼠的逃避潜伏期与游泳总路程逐渐缩短。第5天定位航行实验结果显示,与模型组相比,多奈哌齐组、HLJDT大剂量组、HLJDT中剂量组的逃避潜伏期均显着减少（P<0.01）,HLJDT小剂量组的逃避潜伏期也较模型组减少（P<0.05）,多奈哌齐组与HLJDT大、中、小剂量组的游泳总路程均较模型组减少（P<0.05）。空间探索实验结果显示,多奈哌齐组、HLJDT大剂量组及中剂量组的穿越平台次数与目标象限时间比均较模型组显着增加（P<0.01）,第一次抵达原平台时间均较模型组显着减少（P<0.01）。HLJDT小剂量组的穿越平台次数与目标象限时间比均较模型组增加（P<0.05）,HLJDT小剂量组的第一次抵达平台时间较模型组减少（P<0.05）。（2）黄连解毒汤对AD模型小鼠海马Aβ及相关炎性因子表达的影响在小鼠海马的A β 1-40及Aβ 1-42表达水平方面,与模型组相比,HLJDT大、中、小剂量组的可溶性与不可溶性Aβ 1-40、可溶性与不可溶性Aβ 1-42、总A β 1-40、总Aβ 1-42均显着降低（P<0.01）,多奈哌齐组的不可溶性A β 1-40表达降低（P<0.05）,多奈哌齐组的可溶性与不可溶性Aβ 1-42、可溶性A β 1-40、总Aβ 1-40、总Aβ 1-42的表达量显着降低（P<0.01）;与多奈哌齐组相比,HLJDT大剂量组的可溶性与不可溶性A β 1-40、可溶性与不可溶性A β 1-42、总A β 1-42表达量均降低（P<0.05）,HLJDT大剂量组的总A β 1-40表达水平显着降低（P<0.01）。HLJDT中剂量组的可溶性与不可溶性A β 1-40、可溶性与不可溶性Aβ 1-42、总Aβ 1-40、总A β 1-42表达量均较多奈哌齐组降低（P<0.05）;与HLJDT小剂量组相比,HLJDT大剂量组的可溶性A β 1-40和总A β 1-40表达量降低（P<0.05,P<0.01）,HLJDT中剂量组的可溶性A β 1-40和总Aβ 1-40表达量降低（P<0.05）。在小鼠海马IL-1 β表达量方面,HLJDT大、中、小剂量组与多奈哌齐组的表达量均较模型组降低（P<0.05）。在小鼠海马IL-18表达量方面,HLJDT大、中、小剂量组与多奈哌齐组的表达量均较模型组显着降低（P<0.01）,HLJDT大剂量组、HLJDT中剂量组的表达量均较多奈哌齐组降低（P<0.05）,HLJDT大剂量组、HLJDT中剂量组的表达量均较HLJDT小剂量组降低（P<0.05）。（3）黄连解毒汤对AD模型小鼠海马组织形态学及小胶质细胞活化情况的影响海马CA1区HE染色结果显示,模型组细胞层次减少,组织结构松散,排列紊乱,轮廓不清,神经细胞肿胀,部分细胞有空泡变性或固缩坏死。多奈哌齐组、HLJDT大剂量组、HLJDT中剂量组、HLJDT小剂量组的海马CA1区形态学表现较模型组改善,椎体细胞排列较整齐,组织结构更清晰,空泡变性或固缩坏死的细胞更少。在海马CA1区神经元总数目方面,HLJDT大剂量组、HLJDT中剂量组较模型组显着增加（P<0.01）,多奈哌齐组、HLJDT小剂量组较模型组增加（P<0.05）。海马CA1区免疫组化结果显示,模型组小胶质细胞为活化状态,呈阿米巴状。多奈哌齐组、HLJDT大、中、小剂量组均较模型组的小胶质细胞体积小,染色浅,细胞突起长,活化的小胶质细胞数量减少。在活化小胶质细胞数量方面,HLJDT大剂量组、HLJDT中剂量组较模型组显着减少（P<0.01）,多奈哌齐组、HLJDT小剂量组较模型组减少（P<0.05）,HLJDT大剂量组、HLJDT中剂量组较多奈哌齐组减少（P<0.05）。（4）黄连解毒汤对海马NLRP3炎性小体相关蛋白及mRNA表达的影响免疫印迹法检测结果显示,多奈哌齐组及HLJDT大、中、小剂量组海马NALRP3、ASC、Caspase-1 p20的蛋白表达水平均较模型组显着降低（P<0.01）;多奈哌齐组、HLJDT大剂量组、HLJDT中剂量组海马NALRP3、ASC、Caspase-1 p20的蛋白表达水平均较HLJDT小剂量组降低（P<0.05）;五组海马Pro-caspase-1蛋白表达无统计学差异（P>0.05）。实时荧光定量PCR检测结果显示,多奈哌齐组与HLJDT大、中、小剂量组海马NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表达较模型组显着降低（P<0.01）。其余组间NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA表达均无统计学差异（P>0.05）。结论:1.经临床观察认为,黄连解毒汤治疗AD患者可改善整体认知功能、日常生活活动能力、生活质量。与多奈哌齐相比,黄连解毒汤在改善生活质量方面起效时间更早,在改善日常生活活动能力以及生活质量的疗效维持效应方面优于多奈哌齐。AD患者肾虚、髓减、毒盛与整体认知功能,髓减、毒盛与日常生活能力,毒盛、痰浊与生活质量均存在相关性。黄连解毒汤可有效减轻AD患者阳亢证、火毒证、痰浊证的严重程度,对阳亢证、火毒证的改善作用优于多奈哌齐。黄连解毒汤在服药安全性与患者依从性方面表现良好。2.实验研究表明黄连解毒汤对Tau/APP/PS1三转基因小鼠的学习记忆能力具有改善作用,可下调海马可溶性与不可溶性Aβ 1-40、总Aβ 1-40、可溶性与不可溶性A β 1-42、总A β 1-42以及IL-18、IL-1 β的表达水平,可减轻海马的组织病理损害,对海马小胶质细胞的活化状态具有抑制作用,可下调海马 NLRP3、ASC、Caspase-1 p20 蛋白以及 NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA的表达水平。在不同剂量黄连解毒汤的作用差异方面,大剂量组与中剂量组对海马可溶性A β 1-40、总Aβ 1-40、IL-18表达的抑制作用以及对海马NLRP3、ASC、Caspase-1 p20蛋白表达的下调作用均优于小剂量。上述实验结果提示黄连解毒汤改善Tau/APP/PS1三转基因小鼠的学习记忆能力可能与其抑制海马NLRP3炎性小体相关蛋白及基因表达、调节小胶质细胞活化状态、抑制神经炎症、保护神经元的作用有关。
苏丽燕·赛力木江[3]（2021）在《基于氧化应激反应探讨阿里红多糖抗阿尔茨海默病的作用及机制》文中研究指明目的:从氧化应激角度分别利用整体动物模型和体外细胞模型研究阿里红多糖抗AD的作用及机制。方法:1)72只健康雄性SD大鼠称重并按随机原则分为空白组、模型组、盐酸多奈哌齐组（0.5 mg/kg）、阿里红多糖高、中、低剂量组（100、50、25 mg/kg）,每组12只。采用大鼠双侧海马CA1区注射（5μL/侧）Aβ1-42建立AD大鼠模型。2)药物干预30 d后,Morris水迷宫实验检测行为学变化;HE染色实验观察海马区神经元细胞的形态改变;DCFH-DA荧光探针分析处理FOPS对各组大鼠海马组织及大脑皮质层中活性氧（ROS）水平的影响;酶联免疫吸附（ELISA）法测定3-硝基酪氨酸（3-NT）、4-羟基壬烯醛（4-HNE）、8-羟基脱氧鸟苷（8-OHd G）的含量;荧光定量RT-q PCR和蛋白质印迹（Western blotting）法检测各组大鼠海马组织及大脑皮质层中结构蛋白Keap1、Nrf2及下游抗氧化蛋白HO-1、NQO1 m RNA转录水平及蛋白表达水平。3)采用CCK-8法筛选H2O2最佳造模时间与浓度,FOPS最佳给药浓度及干预时间。4)ELISA法检测FOPS对H2O2诱导的HT22细胞内,Ca2+稳态的变化、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）的含量;生化法检测细胞上清液中NO含量;荧光酶标仪检测细胞内ROS水平;Hoechst 33342荧光染色法观察细胞凋亡的形态学改变;采用Annexin V-FITC流式细胞术检测FOPS对细胞凋亡率的影响。结果:1)Morris水迷宫实验结果显示:与模型组比较,FOPS高、中剂量组逃避潜伏期均明显缩短,原平台所在象限滞留时间百分比和有效区域进入次数明显增多（P<0.01）;HE染色观察结果表明:与模型组比较,FOPS高、中剂量组的锥体细胞数目明显增多、海马神经元细胞形态较完整、大多数较正常、排列较规整紧密;与模型组比较,FOPS高、中剂量组干预治疗30 d后,AD大鼠海马组织及大脑皮质层中ROS含量明显降低（P<0.01）;3-NT、4-HNE、8-OHd G的含量较模型组明显降低（P<0.01）;与模型组比较,FOPS高、中剂量组通过降低AD大鼠海马组织及大脑皮质层中Keapl基因的m RNA转录水平（P<0.01）及蛋白表达水平（P<0.01）,促进Nrf2的激活,从而升高其下游抗氧化反应元件HO-1、NQO1基因的m RNA转录水平（P<0.01）及蛋白表达水平（P<0.01）。2)CCK-8法结果显示:H2O2（500μM）处理HT22细胞4 h是最佳造模时间与浓度、FOPS在6.25～50μg/m L浓度范围内对HT22细胞存活率无毒性作用;ELISA实验结果显示:与模型组比较,FOPS干预组能减少MDA、Ca2+含量,增加T-AOC含量,差异有统计学意义（P<0.05）。生化法、荧光酶标仪法检测结果显示:与模型组比较,FOPS干预组能降低细胞内NO和ROS水平（P<0.05）。Hoechst 33342染色结果显示:与模型组比较,FOPS干预组细胞形态完整性接近于正常组细胞;Annexin V-FITC流式细胞术检测结果显示:与模型组比较,FOPS干预组能降低细胞早期凋亡率,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:在体内实验,阿里红多糖能够改善Aβ1?42诱导的AD大鼠脑内氧化应激状态,起到改善认知障碍和保护神经元的作用。在体外实验,阿里红多糖通过发挥抗氧化作用,减少H2O2诱导的HT22细胞氧化损伤,提高细胞存活率,抑制细胞凋亡。
吴文雪[4]（2020）在《二苯乙烯苷对APP/PS1/Tau三转基因小鼠Tau蛋白异常磷酸化的干预及机制研究》文中提出目的:本研究采用高表达人类Tau基因突变的APP/PS1/Tau三转基因痴呆（Three transgene Alzheimer’s disease,3×Tg-AD）小鼠为研究对象,观察二苯乙烯苷（Stilbene Glucoside,TSG）对3×Tg-AD小鼠Tau蛋白磷酸化及相关蛋白激酶、蛋白磷酸酶及蛋白激酶调控因子表达的影响,探讨TSG对3×Tg-AD小鼠Tau蛋白磷酸化调控的影响及作用机制,为开发阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）早期干预药物提供实验依据。方法:选取8月龄3×Tg-AD雄性小鼠45只,随机分为模型组、阳性对照组、TSG低剂量组、TSG中剂量组、TSG高剂量组,每组9只。另外,选择8月龄C57BL/6J雄性小鼠9只,作为正常对照组。进行灌胃对应药物连续治疗60天。给药结束后采用Morris水迷宫方法检测各组小鼠学习记忆能力;尼氏染色法观察大脑皮层、海马区尼氏小体变化情况;免疫荧光（Immunofluorescence,IF）染色法检测各组小鼠脑组织磷酸化Tau蛋白（Ser404位点）、Tau蛋白分布及表达水平;免疫组织化学（Immunohis tochemical,IHC）染色法检测各组小鼠皮层、海马P39蛋白分布及表达水平;采用实时定量反转录聚合酶链式反应（real time quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR）方法检测各组小鼠细胞周期依赖蛋白激酶（Cyclin-Dependent Kinase 5,CDK5）、细胞外调节蛋白激酶（Extracellular Regulated Protein Kinases,ERK1/2）、C-Jun氨基末端激（C-Jun N-Terminalkinase,JNK）、钙调神经磷酸酶（Protein phosphortase 2B,PP2B）、蛋白磷酸酶1（Protein Phosphatase 1,PP1）mRNA转录改变;采用蛋白印迹（Western Blotting,WB）法检测各组小鼠脑组织中磷酸化Tau蛋白（Thr205位点）、CDK5、ERK1/2、JNK、PP2B、PP1的蛋白表达水平。结果:（1）TSG对小鼠学习记忆能力的影响:与正常对照组比较,模型组小鼠逃避潜伏期显着延长、原平台象限停留时缩短、穿越平台次数显着减少（P<0.01）;与模型组比较,阳性对照组及TSG各剂量组小鼠逃避潜伏期显着缩短、原平台象限停留时间显着延长、穿越平台次数显着增多（P<0.05或P<0.01）;与阳性对照组比较,TSG中、高剂量组小鼠原平台象限停留时间显着延长,穿越平台次数显着增多（P<0.05或P<0.01）;（2）TSG对小鼠尼氏染色的影响:与正常对照组比较,模型组小鼠神经元尼氏小体数量显着减少、着色浅;与模型组比较,阳性对照组及TSG各剂量组小鼠神经元尼氏小体数量显着增加、着色较深;与阳性对照组比较,TSG各剂量组小鼠神经元尼氏小体数量及着色无明显变化;（3）TSG对小鼠Tau蛋白磷酸化的影响:蛋白印迹结果提示:与正常对照组比较,模型组小鼠脑组织磷酸化Tau蛋白（Thr205位点）表达显着增高（P<0.01）;与模型组比较,阳性对照组及TSG各剂量组小鼠脑组织磷酸化Tau蛋白（Thr205位点）表达量显着降低（P<0.01）;与阳性对照组比较,TSG中、高剂量组小鼠脑组织磷酸化Tau蛋白（Thr205位点）表达量显着降低（P<0.05或P<0.01）。免疫荧光染色结果提示:与正常对照组比较,模型组小鼠脑组织Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白（Ser404位点）平均光密度值显着增高（P<0.01）;与模型组比较,阳性对照组及TSG各剂量组小鼠Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白（Ser404位点）平均光密度值显着降低（P<0.01）;与阳性对照比较,TSG各剂量组小鼠Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白（Ser404位点）平均光密度值无明显统计学差异;（4）TSG对小鼠Tau蛋白激酶的影响:蛋白印迹结果提示:与正常对照组比较,模型组小鼠脑组织CDK5、ERK1/2、JNK蛋白表达显着增高（P<0.01）;与模型组比较,阳性对照组及TSG各剂量组小鼠脑组织CDK5、ERK1/2、JNK蛋白表达显着降低（P<0.05或P<0.01）;与阳性对照组比较,TSG高剂量组小鼠脑组织ERK1/2蛋白表达量显着降低（P<0.05）,TSG各剂量组小鼠脑组织JNK蛋白表达量显着降低P<0.01);q RT-PCR结果提示:与正常对照组比较,模型组小鼠脑组织CDK5、ERK1/2、JNK mRNA相对表达量显着增高（P<0.01）;与模型组比较,TSG各剂量组小鼠脑组织CDK5 mRNA相对表达量显着增高（P<0.05或P<0.01）,阳性对照组及TSG各剂量组小鼠脑组织ERK1/2 mRNA相对表达量显着增高（P<0.05或P<0.01）,TSG高剂量组小鼠脑组织JNK mRNA相对表达量显着增高（P<0.05）;与阳性对照组比较,TSG高剂量组小鼠脑组织CDK5、JNK mRNA相对表达量显着降低（P<0.05）;（5）TSG对小鼠Tau蛋白磷酸酶的影响:蛋白印迹结果提示:与正常对照组比较,模型组小鼠脑组织PP2B、PP1蛋白表达显着降低（P<0.01）;与模型组比较,阳性对照组及TSG各剂量组小鼠脑组织PP2B、PP1蛋白表达显着增高（P<0.05或P<0.01）;与阳性对照组比较,TSG中、高剂量组小鼠脑组织PP2B、PP1蛋白表达显着增高（P<0.05或P<0.01）;q RT-PCR结果提示:与正常组比较,模型组小鼠脑组织PP2B、PP1 mRNA的相对表达量显着降低（P<0.01）;与模型组比较,阳性对照组及TSG各剂量组小鼠脑组织PP2B mRNA相对表达量显着增高（P<0.05或P<0.01）,TSG各剂量组小鼠脑组织PP1 mRNA相对表达量显着增高（P<0.05或P<0.01）;与阳性对照组比较,TSG高剂量组小鼠脑组织PP2B、PP1 mRNA相对表达量显着增高（P<0.05或P<0.01）;（6）TSG对小鼠Tau蛋白激酶调控因子的影响:与正常对照组比较,模型组小鼠脑海马、皮层P39平均光密度和阳性神经元细胞总数目明显增多（P<0.01）;与模型组比较,与模型组比较,阳性对照组和TSG各剂量组小鼠海马、皮层P39平均光密度和阳性神经元细胞总数目显着降低（P<0.01或P<0.05）;与阳性对照组比较,TSG高剂量组小鼠脑皮层、海马P39阳性细胞数目显着减少（P<0.05）。结论:TSG能一定程度修复3×Tg-AD小鼠损伤神经元,提高3×Tg-AD小鼠的学习记忆能力。其机制可能是通过下调Tau蛋白相关的蛋白激酶CDK5、ERK1/2、JNK及其调控因子P39,上调相关的蛋白磷酸酶PP2B、PP1,抑制Tau蛋白磷酸化有关。
彭红梅[5]（2020）在《黄连解毒汤含药脑脊液对Aβ1-42致BV2细胞凋亡及炎症反应的机制研究》文中研究说明目的:探讨黄连解毒汤含药脑脊液对寡聚体Aβ1-42诱导的BV2细胞凋亡与炎症反应的影响及其作用机制。方法:利用寡聚体Aβ1-42诱导BV2细胞,复制细胞损伤模型。将处于对数期的BV2细胞随机分为空白对照组,Aβ模型组,石杉碱甲含药脑脊液组、黄连解毒汤含药脑脊液低、中、高剂量组,分别加入10%空白脑脊液,10%空白脑脊液,10%石杉碱甲含药脑脊液,5%、10%、20%黄连解毒汤含药脑脊液;除空白组外,其余各组加入终浓度为10μM寡聚体Aβ1-42,复制小胶质细胞凋亡模型。采用流式细胞术检测各组BV2细胞凋亡情况;Elisa法检测BV2细胞上清液中IL-10、IL-6、IFN‐γ表达水平;Western blot法检测BV2细胞Arg-1与i NOS蛋白表达水平。结果:1.与空白对照组比较,Aβ模型组BV2细胞凋亡率明显增加（*P<0.05）,细胞上清液中IL-10显着降低（*P<0.01）,IL-6、IFN‐γ水平明显升高（*P<0.05）。2.黄连解毒汤含药脑脊液能够降低寡聚体Aβ1-42诱导BV2细胞凋亡。3.黄连解毒汤含药脑脊液能够升高BV2细胞上清液中抗炎因子IL-10（*P<0.05）,降低促炎因子IL-6、IFN‐γ水平（*P<0.05）。4.黄连解毒汤含药脑脊液能够上调BV2细胞中Arg-1蛋白表达水平,下调i NOS于Cleaved Caspase-3蛋白表达水平（*P<0.05）。结论:1.寡聚体Aβ1-42能够诱导BV2细胞凋亡,抑制BV2细胞M2型激活,促进BV2细胞促炎M1型激活,释放IL-6、IFN‐γ等促炎因子。2.黄连解毒汤含药脑脊液能够改善寡聚体Aβ1-42诱导的小胶质细胞炎性因子释放,其作用机制可能与黄连解毒汤含药脑脊液能够保护小胶质细胞,减少小胶质细胞凋亡,从而减少IFN‐γ合成,促进抗炎因子IL-10释放,促进BV2细胞M2型激活,减少促炎M1型激活,降低IL-6表达水平有关。
李素华[6]（2020）在《靶向重组Hsp90α亲和性多肽库筛选》文中提出目的:热休克蛋白（Hsp）是细胞针对不同类型的应激时产生的具有保护细胞内稳态的一类分子伴侣。哺乳动物Hsp可根据其分子量分为几个亚家族,即Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp27等。HSP90蛋白的两个基因编码分别是Hsp90α和Hsp90β,两者氨基酸序列有80%的同源,并一起构成正常细胞中总蛋白质的2-3%,HSP90α的表达可被应激刺激诱导,而HSP90β在细胞中持续稳定表达。Hsp90α是调控生理和病理条件下细胞内稳态的主要分子伴侣,参与多种疾病的发生。Hsp90α作为多个疾病（如老年痴呆,心血管疾病,恶性肿瘤等）治疗药物潜在靶点已受到广泛的关注。在AD病理过程中,Hsp90α被诱导表达,并结合过度磷酸化的tau蛋白和Aβ蛋白,参与tau和Aβ纤维的形成,级联放大老年斑和tau蛋白积聚,从而促进AD的发生发展。Hsp90α抑制剂不但防止tau聚集而且溶解已经聚合的tau,在Aβ的加工和清除中也起重要作用,目前认为Hsp90α抑制剂对Aβ诱导的毒性具有抑制作用,能够挽救Aβ诱导的小鼠认知障碍,抵御tau蛋白和Aβ蛋白介导的炎症损伤。因此,Hsp90α可能是治疗AD病人的一个潜在药物靶点。针对Hsp90α的化学抑制剂已有多种,有些已用于肿瘤治疗的二期临床试验,这为Hsp90α作为药物靶向奠定了基础,但是这些化学药物是否能通过血脑屏障,是否对正常神经细胞或神经支持细胞具有毒性等还没有细致的评价。多肽作为靶向药物越来越受到重视,如康柏西普多肽药物治疗AMD等。多肽通过与靶向蛋白的特异作用,可激活或抑制靶向蛋白的功能,这种方式具有特异性强,结合能力高,在细胞内的靶向效应高等特点。因此,我们提出靶向Hsp90α蛋白多肽药物研究课题,噬菌体7肽库是目前常用的靶向肽筛选库。因此我们提出一个假设,从噬菌体七肽库筛选Hsp90α亲和性多肽并对其进行体外Hsp90α结合活性鉴定。目的是寻找能结合并调控Hsp90α蛋白活性的多肽,为Hsp90α靶向药物提供更多的选择。方法:（1）重组质粒pGEX-6P-1/Hsp90α的构建:根据NCBI公布的全长Hsp90α的c DNA序列设计引物,通过PCR扩增基因片段,分别对Hsp90α基因片段和质粒pGEX-6P-1经Sma1和Xho1双酶切。目的片段和载体酶连,重组载体转化大肠杆菌DH5α,进行单克隆筛选,对阳性克隆菌扩增、测序、鉴定,证明了重组质粒pGEX-6P-1/Hsp90α构建成功。（2）体外表达重组GST-HSP90a蛋白:将pGEX-6P-1/Hsp90α转化表达细菌BL21,在IPTG诱导下,表达HSP90α蛋白,SDS-PAGE检测Hsp90α蛋白的表达,Western blot鉴定目的蛋白。（3）Hsp90α蛋白的纯化:应用GST-glutathione sepharose 4b beads介导的亲和层析方法纯化GST-Hsp90α蛋白,超滤器浓缩和透析蛋白,得到纯度较高的GST-Hsp90α蛋白。（4）筛选与Hsp90α结合的多肽:GST-Hsp90α蛋白包备在96孔板上,将稀释好的多肽噬菌体库加入96孔板进行结合试验,洗涤未结合的噬菌体,将结合的噬菌体,在细菌中扩增,以此方法对多肽库进行3轮的筛选。提取阳性噬菌体DNA,测序鉴定阳性多肽。（5）phage ELISA体外测定多肽与Hsp90α的亲和性。结果:1.成功构建了重组质粒pGEX-6P-1/Hsp90α。2.获得2.8mg/ml纯度较高的GST-Hsp90α蛋白。3.以Hsp90α为靶蛋白,经过3轮的噬菌体肽库筛选,得到25个富集的噬菌体克隆,phage ELISA鉴定了4个噬菌体克隆与Hsp90α有很好的亲和性。结论:应用噬菌体展示的7肽库可筛选到Hsp90α的亲和性多肽。为下一步进行多肽调控HSP90a分子伴侣活性以及对AD疾病治疗提供了前期研究基础。
刘珍洪[7]（2020）在《基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨参枝苓口服液对AD的保护作用》文中研究表明目的本课题从中医心脑相关理论出发,选用“从心论治”代表方参枝苓口服液,基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨其干预阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的作用机制。AD是老年痴呆症最常见的类型。临床可表现为记忆、情志和行为障碍,对患者家庭、护理人员造成了沉重的经济和精神负担。近年来研究表明,髓鞘损伤与AD、帕金森疾病（Parkinson’sdisease,PD）和中风等神经退行性疾病相关。其中发现AD与髓鞘的破坏和丢失关系密切。研究发现髓鞘损伤早于认知障碍、老年斑（Senileplaque,SPs）和神经纤维缠结（Neurofibrillary tangles,NFTs）等病理改变,髓鞘损伤可能在AD早期认知障碍中发挥关键作用。PI3K/Akt-mTOR通路是髓鞘形成的强大驱动力,是CNS髓鞘蛋白表达的主要驱动因素。一些研究显示神经元PI3K/Akt-mTOR信号传导的异常和持续激活是AD的早期特征。mTOR在构成髓鞘的少突胶质细胞中对脂质合成,转录因子调节,和细胞骨架具有显着作用,这是少突胶质细胞发育不可或缺的过程。除外,表观遗传阻滞、脂质代谢异常皆与AD的病理密切相关。本研究通过体内实验探索参枝苓口服液是否有改善损伤髓鞘的作用,同时观察体外是否能通过保护Aβ42损伤的少突胶质细胞进而维持髓鞘完整性而防治早期AD。并基于PI3K/Akt-mTOR信号通路、表观遗传调控及脂质代谢探讨其可能机制,为参枝苓口服液保护髓鞘提供可能的证据。方法1.36只3月龄雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠随机分为模型组,多奈哌齐组,参枝苓口服液组,每组12只。同背景、同月龄野生型C57BL/6J小鼠12只作为正常组。多奈哌齐组给予多奈哌齐（0.92mg.kg-1·d-1）灌胃给药,参枝苓口服液组给予参枝苓口服液（2.9ml·kg-1·d-1）灌胃给药。正常组和模型组灌予等体积的0.5%CMC。2.利用Y迷宫实验研究参枝苓口服液灌胃3个月后对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠空间识别和记忆能力的影响。3.利用透射电镜研究参枝苓口服液灌胃3个月后对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马中淀粉样斑块、髓鞘及少突胶质细胞超微结构的影响。4.利用免疫组化和Western blot方法研究参枝苓口服液灌胃3个月后对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马中髓鞘相关蛋白MBP、PLP和MAG与Aβ42蛋白的表达变化影响。5.40只雄性SD成年大鼠（200±20g）随机分为正常组和参枝苓口服液组,参枝苓口服液组以成人（70kg）等效剂量的2倍量进行灌胃,正常组灌服等体积0.5%CMC,每天1次,连续7d,制备参枝苓口服液含药血清。6.UHPLC-MRM-MS/MS方法检测参枝苓口服液含药血清主要有效成分。7.Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞,建立拟AD体外细胞模型。8.利用CCK-8法筛选参枝苓口服液含药血清及阳性药多奈哌齐对OLN-93少突胶质细胞的安全剂量和有效剂量。9.利用Western blot、RT-qRCR法、免疫荧光研究参枝苓口服液含药血清对Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞髓鞘相关蛋白和PI3K/Akt-mTOR信号通路蛋白及mRNA表达影响。10.利用PI3K/Akt-mTOR信号通路抑制剂LY294002（PI3K抑制剂）及Rapamycin（mTOR抑制剂）进一步确认PI3K/Akt-mTOR信号通路在参枝苓口服液髓鞘保护中的参与作用。11.利用染色质免疫共沉淀（CHIP）实验观察参枝苓口服液对Aβ42损伤少突胶质细胞OLN-93的乙酰化组蛋白与MBP基因相互作用。12.利用LC-MS/MS法观察参枝苓口服液对Aβ42损伤少突胶质细胞OLN-93脂质代谢的影响。结果1.体内动物实验参枝苓口服液和阳性对照药多奈哌齐连续灌胃3个月后可以明显延长APPswe/PS1dE9双转基因小鼠在新异臂中活动的路程和持续时间。透射电镜下可观察到在损伤的少突胶质细胞附近淀粉样斑块的沉积,而正常组和治疗组未观察到。同时,透射电镜下观察到参枝苓口服液和多奈哌齐可以明显改善髓鞘板层的结构、髓磷脂的崩解以及少突胶质细胞的结构破坏。在此基础上,对各组小鼠海马进行免疫组化及Western blot实验结果也显示,参枝苓口服液和多奈哌齐可以明显上调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠海马中髓鞘相关蛋白MBP、PLP和MAG的蛋白表达。同时,APPswe/PS1dE9双转基因模型小鼠海马中观察到Aβ42的蛋白表达上调,参枝苓口服液和多奈哌齐可以明显下调小鼠海马中Aβ42的蛋白表达。2.UHPLC-MRM-MS/MS方法检测参枝苓口服液及参枝苓含药血清主要有效成分参枝苓口服液中,芍药内酯苷、肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这5种代谢物都能检测到。且浓度含量:甘草酸>芍药苷>芍药内酯苷>肉桂酸>甘草苷。参枝苓口服液大鼠含药血清中,可以检测到肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这4种代谢物。浓度含量:甘草酸>肉桂酸>芍药苷>甘草苷。芍药内酯苷虽然在质谱中可以检测到峰,但是信号可能与噪音相似,定量检测未检测出含量。提示,参枝苓口服液确实可以经过灌胃入血发挥作用,参枝苓口服液髓鞘保护作用可能与肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这4种成分密切相关。3.体外细胞实验Aβ42可以诱导OLN-93少突胶质细胞引起损伤,100μMAβ42孵育细胞16h以及1μM、10μM和100μM的Aβ42孵育细胞24h和48h后可以明显降低细胞活力。同时,1～100μM的Aβ42孵育细胞24h,细胞的损伤率明显增加。1～100μM的Aβ42孵育24h可以对细胞形态造成破坏,引起细胞固缩,碎裂,死亡。并且,Aβ42孵育24h可以显着升高OLN-93细胞的凋亡水平。用CCK-8法筛选参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐的安全剂量、给药时间范围结果显示,1%～20%浓度的参枝苓口服液含药血清孵育3～48h对正常OLN-93细胞不具有细胞毒性,甚至16%和20%浓度的参枝苓口服液含药血清孵育24h和48h可以显着提高正常OLN-93细胞的细胞活力。多奈哌齐对正常OLN-93细胞的安全剂量及时间为:孵育 3h（0.01μM,0.1μM,1 μM,10μM,100μM）;孵育 24h（0.01 μM,0.1 μM,1μM,10μM,100μM）;孵育 48h（0.01 μM,0.1μM,1 μM,10μM）。CCK-8法筛选参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐的有效剂量、给药时间范围,16%,20%参枝苓口服液含药血清孵育24h及48h。1 μM,10μM和100μM多奈哌齐孵育3h或24h;0.1μM,1μM和10μM多奈哌齐孵育48h。Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞,与体内动物实验一致,表现为Aβ42明显下调少突胶质细胞髓鞘相关蛋白MBP、PLP、MAG和MOG的表达,并且下调MBP和PLP的mRNA表达水平,而参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐干预后可以明显逆转这些蛋白和mRNA的表达水平。另一方面,Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞还表现为引起PI3K/Akt-mTOR信号通路的异常。Aβ42不仅可以下调PI3K,Akt及mTOR的蛋白和mRNA表达水平,还可以明显下调p-PI3K,p-Akt及p-mTOR的蛋白表达水平,而参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐干预后可以明显逆转这些蛋白和mRNA的表达水平。参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐对Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞的保护作用可以被PI3K/Akt-mTOR信号通路的抑制剂完全逆转,具体表现为,无论是使用LY294002,Rapamycin还是联合使用LY294002与Rapamycin都可以完全逆转参枝苓口服液含药血清和多奈哌齐上调MBP的能力。CHIP实验显示:Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞后组蛋白H3乙酰化水平升高。多奈哌齐和参枝苓口服液含药血清下调组蛋白H3乙酰化水平。同时,Aβ42损伤OLN-93少突胶质细胞后,更多的基因MBP发生了组蛋白H3乙酰化。多奈哌齐和参枝苓口服液含药血清可以下调组蛋白H3乙酰化的MBP基因水平。脂质代谢结果显示:正常组的CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS显着高于模型组。模型组的Cer、DG、SM和TG显着高于正常组。两组Cerp、Hex2Cer、HexCer和Sphingosine含量均等。多奈哌齐的Cer、CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS显着高于模型组。模型组的SM和TG明显高于多奈哌齐组。参枝苓口服液的Cer、DG、CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、SM显着高于模型组。模型组的TG明显高于参枝苓口服液组。结论参枝苓口服液具有改善损伤髓鞘的作用,同时参枝苓口服液含药血清能保护Aβ42损伤的少突胶质细胞进而维持髓鞘完整性而防治早期AD。参枝苓口服液的髓鞘保护作用与PI3K/Akt-mTOR信号通路、表观遗传调控及脂质代谢密切相关。首先,参枝苓口服液可能通过上调PI3K,Akt及mTOR mRNA的水平,引起PI3K,Akt及mTOR蛋白的表达水平上调,增加PI3K,Akt及mTOR的磷酸化,增强PI3K/Akt-mTOR信号通路的活性,从而发挥少突胶质细胞及髓鞘保护作用。其次,参枝苓口服液通过下调组蛋白H3乙酰化水平、下调组蛋白H3乙酰化的MBP基因水平从而保护少突胶质细胞。再者,参枝苓口服液通过上调CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS的含量,下调TG含量,调整脂质代谢紊乱从而保护少突胶质细胞。最后,参枝苓口服液髓鞘保护作用的物质基础则可能与肉桂酸、甘草酸、甘草苷和芍药苷这4种成分密切相关。
王慧婵[8]（2020）在《龟龄集对AD认知功能的疗效评价及突触和髓鞘相关作用研究》文中指出阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是痴呆最常见的类型,全球患病人数呈现迅速增长,给社会和家庭带来沉重的经济负担。但目前现代医学对AD的治疗效果并不理想。然而,中药复方具有多种活性成分,其治疗AD具有多途径、多靶点、协同增效的特点,可发挥整体调节的作用。龟龄集是补肾抗衰老复方,探索其在AD中的作用及可能的机制具有重要的应用价值。目的:评价龟龄集治疗AD的临床疗效,探讨龟龄集对SAMP8小鼠学习记忆能力和突触髓鞘相关蛋白表达的影响,为龟龄集治疗AD的临床应用提供科学依据。方法:1临床研究:采用随机、双盲、对照试验,一共纳入AD肾虚髓减型患者60例,随机分为试验组和对照组,试验组给予龟龄集胶囊治疗,对照组给予银杏叶片治疗,疗程24周。观察治疗前后患者的ADAS-cog、MMSE、ADL和中医证候积分变化情况和安全性。2实验研究:64只SPF级SAMP8小鼠随机分为模型组（Model）、龟龄集低剂量组（GLJ-L）、龟龄集高剂量组（GLJ-H）和银杏叶组（YXY）,以SAMR1为正常对照（Control）,每组16只。GLJ-L、GLJ-H、YXY组分别给予龟龄集低剂量、龟龄集高剂量和银杏叶片,模型与对照组给予等体积蒸馏水,灌胃12周。通过新物体识别和Morris水迷宫实验,观察药物干预对SAMP8小鼠认知能力的影响;HE染色和尼氏染色观察脑组织病理形态和尼氏小体数量变化;Western blot和荧光定量PCR分别检测海马组织GAP43、SYP、MBP、BDNF、TrkB 蛋白和 mRNA 表达水平。结果:1临床研究结果:（1）神经心理测评量表评分变化:与治疗前比,治疗12周和治疗24周试验组和对照组ADAS-cog评分均明显下降（P<0.01或P<0.05）,组间比较,治疗12周和治疗24周,两组ADAS-cog评分无统计学差异（P>0.05）。与治疗前比,治疗12周和治疗24周试验组和对照组MMSE评分均明显上升（P<0.01）,组间比较,治疗12周和治疗24周两组MMSE评分无统计学差异（P>0.05）。（2）日常生活能力得分变化:与治疗前比,试验组和对照组ADL量表积分未见明显变化（P>0.05）。（3）中医证候积分变化,与治疗前比,治疗24周后试验组和对照组积分明显下降（P<0.01）,试验组中腰膝酸软、倦怠思卧有效率明显高于对照组（P<0.01）。试验组中医证候总有效率为59.26%,对照组总有效率为19.05%,差异有统计学意义（P<0.01）。（4）安全性评价:两组患者在治疗期间未出现严重不良反应,治疗期间两组患者血、尿常规、肝（ALT、AST）肾（UREA、CRE）功能、心电图未见明显异常变化。2实验研究结果:（1）龟龄集对SAMP8小鼠识别记忆能力的影响与对照组比,模型组SAMP8小鼠辨别指数有下降趋势,差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组比,GLJ-L、GLJ-H和YXY组SAMP8小鼠辨别指数有升高趋势,无统计学意义（P>0.05）。（2）龟龄集对SAMP8小鼠空间学习记忆力的影响定位航行训练结果显示:各组小鼠潜伏期随训练天数逐渐缩短。与对照组比,模型组逃避潜伏期明显延长（P<0.01）。与模型组比,GLJ-L、GLJ-H组和YXY组潜伏期明显缩短（P<0.01）。组内比较,与第一天潜伏期比较,对照组、GLJ-L、GLJ-H组第3天表现出明显的学习能力,潜伏期短于第一天（P<0.05,P<0.05,P<0.01）,但GLJ-L、GLJ-H组潜伏期长于对照组;YXY组小鼠学习能力改善出现在第2天（P<0.05）,潜伏期长于对照组。同一天内,与对照组比,模型组潜伏期均较长（P<0.05,P<0.01）。与模型组比,GLJ-H和YXY组潜伏期第2-5明显缩短（P<0.01）,GLJ-L组潜伏期第5天明显缩短（P<0.05）。空间探索结果显示:与对照组比,模型组穿台次数、在目标象限停留时间比和目标象限游泳路程比均明显减少（P<0.01,P<0.01,P<0.05）。与模型组比,GLJ-L和GLJ-H组穿台次数增加有统计学意义（P<0.05）;GLJ-L、GLJ-H和YXY组目标象限游泳时间比增加有统计学意义（P<0.05）;GLJ-H组目标象限游泳路程比增加有统计学意义（P<0.01）。（3）龟龄集对SAMP8小鼠海马病理形态的影响对照组小鼠海马CA1区细胞排列紧密、整齐有序,形态规则,轮廓清晰,层次明显,核仁清晰,尼氏小体数量较多。模型组海马CA1区细胞数量减少、排列无序,轮廓不清,核固缩或消失,尼氏小体数量明显减少。与模型组相比,YXY、GLJ-L、GLJ-H组小鼠海马CA1区病理形态得到改善,细胞排列有层次而紧密,细胞数量和层数增加,尼氏小体数量较多。（4）龟龄集对SAMP8小鼠突触、髓鞘相关蛋白的表达的影响与对照组比,模型组GAP43、MBP的蛋白和mRNA表达水平下降（P<0.01）,SYP mRNA表达水平明显下降（P<0.01）。GLJ-L、GLJ-H组GAP43、MBP的蛋白和mRNA表达显着增加（P<0.05或P<0.01）、SYP mRNA表达水平也明显升高（P<0.01）。（5）龟龄集对BDNF/TrkB信号通路的影响与对照组比,模型组BDNF蛋白和mRNA表达水平显着降低（P<0.01）。TrkB蛋白表达量降低无统计学意义（P>0.05）。与模型组比,GLJ-H组BDNF、TrkB蛋白表达水平显着升高（P<0.01,P<0.05）,mRNA表达量也显着升高（P<0.01）。结论:1临床研究结论:龟龄集可以降低轻中度AD患者的ADAS-cog评分和中医证候积分,增加MMSE评分,改善认知功能,治疗期间无严重不良反应。2实验研究结论:龟龄集改善SAMP8小鼠学习记忆能力,其作用机制可能与增加海马CA1区神经元数量,调节BDNF/TrkB信号通路,促进突触、髓鞘相关蛋白表达有关。
张耀尹[9]（2020）在《益气健脾法改善脾气虚证认知障碍大鼠炎症和过氧化损伤的实验研究》文中研究指明目的:本研究在课题组前期成果以及AD病理机制探索的现代研究基础上建立脾气虚证认知障碍大鼠模型,从模糊数学、行为学和病理学等层面对模型进行评价。分别设立中药和西药治疗组对模型大鼠进行治疗,通过检测用药前后大鼠脑组织中的炎症因子水平、脂质过氧化产物含量、氧化酶活性、以及TLR4/My D88/NF-κB炎症通路上关键靶点分子的表达,从脾失健运的角度探讨益气健脾法对改善认知障碍大鼠神经炎症和过氧化损伤的作用,为中医益气健脾为原则治疗认知障碍疾病提供理论依据。材料与方法:选用2～3月龄的SPF级健康SD大鼠共60只,雌雄各30只,随机分为正常对照组、脾气虚证认知障碍模型组、阳性药物对照组和益气健脾益智方组。采用饮食不节+劳累过度的复合手法复制脾气虚证大鼠模型,在此基础上再通过Aβ1-42海马注射建立脾气虚证认知障碍模型,通过模糊数学方法、水迷宫行为测验和病理学观察等方法对模型进行评价。分别用益气健脾益智方和安理申连续灌胃治疗4周,结束后取大鼠全脑及海马组织。用相应试剂盒检测大鼠脑组织中TNF-α、IL-6、MDA、SOD等炎症和氧化应激指标水平,用Western Blot和实时荧光定量PCR分别检测大鼠脑组织中TLR4、My D88、NF-κB的蛋白表达和mRNA表达水平。结果:1大鼠体重、食量变化情况:造模期间,与正常组相比,造模组（指模型组、西药组、中药组,下同）大鼠的体重和食量增幅均表现为降低;治疗期间,与模型组相比,西药组、中药组大鼠体重和食量增幅均表现为升高。2大鼠行为学检测结果:定位航行训练结果显示,造模组的逃避潜伏期相比于正常组日渐增加;空间探索实验结果显示,造模组平台象限活动时间占比、平台区域穿越次数明显少于正常组（P<0.01）,首次抵达平台区域耗时则明显多于正常组（P<0.01）。3大鼠脑组织病理学检测结果:大鼠脑海马区经HE染色后,其中正常组大鼠神经元排列规整、数量较多、染色均匀,细胞核呈类圆形,核仁清楚。模型组大鼠神经锥体细胞数量减少、排列紊乱、间隙增宽,胞核深染,胞浆皱缩,大量胶质细胞增生,周围组织形成水肿。与模型组相比,西药和中药组大鼠经给药治疗后的组织形态均明显恢复,细胞数量增加,排列更为规律,核染相对清晰,胶质细胞增生程度也明显好转。4大鼠脑组织炎症与氧化应激指标检测结果:模型组大鼠脑组织中TNF-α、IL-6、MDA含量与正常组相比均显着提高（P<0.01）,SOD活性显着下降（P<0.01）;与模型组比较,西药组、中药组的TNF-α、IL-6、MDA含量均明显下降（P<0.01）,SOD活性显着升高（P<0.01）。5大鼠脑组织中TLR4、My D88、NF-κB蛋白表达检测结果:Western Blot检测结果显示,与正常组比较,模型组TLR4、My D88、NF-κB的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）;与模型组比较,西药组和中药组TLR4、My D88、NF-κB的蛋白表达水平均不同程度下降（P<0.01）。6大鼠脑组织中TLR4、My D88、NF-κB mRNA表达检测结果:实时荧光定量PCR检测结果显示,与正常组比较,模型组TLR4、My D88、NF-κB的mRNA表达水平显着升高（P<0.01）;与模型组比较,西药组和中药组TLR4、My D88、NF-κB的mRNA表达水平均不同程度下降（P<0.01）。结论:1脾气虚证认知障碍大鼠的脑细胞结构、数量和排列等发生了改变,构成了脾气虚证认知障碍发生的病理学基础。2脾气虚证认知障碍大鼠脑内神经炎症反应和氧化应激反应被持续激活,导致大量炎性因子和氧自由基产生,促使神经细胞变性、淀粉样蛋白生成并沉积,此过程参与了脾气虚证认知障碍的现代医学发病机制。3脾气亏虚作为认知障碍的中医病机之一,促进了认知障碍大鼠脑内炎症反应和脂质过氧化损伤。以益气健脾法治疗可以调节TLR4/My D88/NF-κB信号通路的活跃程度,减轻认知障碍大鼠脑内的炎症反应和过氧化损伤,延缓认知障碍的病变过程。
马冉[10]（2020）在《基于CDK5 DNA甲基化研究电针对SAMP8小鼠海马区Tau蛋白磷酸化的影响及作用机制》文中研究说明目的本项研究基于表观遗传修饰紊乱与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）发病的高度相关性,以细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）DNA甲基化水平降低致使其过度激活进而导致tau蛋白过度磷酸化为切入点,旨在探讨电针对SAMP8小鼠学习记忆能力、神经元及突触超微结构的影响,初步阐明电针防治SAMP8小鼠学习记忆障碍的效应及表观遗传学作用机制,以期为电针干预AD提供科学的实验依据。方法选取SPF级5月龄雄性SAMR1和SAMP8小鼠共72只,体重（13±3）g,适应性喂养一周后,进行Morris水迷宫实验筛选出合格小鼠,随机分为SAMR1正常对照组12只,SAMP8小鼠60只随机分为模型组、假电针组、2Hz电针组、抑制剂组和电针+抑制剂组,每组12只。对照组和模型组不做任何处理,在治疗组治疗的同时,用相同规格的固定台进行抓取和捆绑;电针组选用“百会”、“肾俞”干预,于“百会”向前平刺3<sup>5 mm,“肾俞”向后正中线、与皮肤呈45°角斜刺5 mm。接上HA NS-200A型电针治疗仪,一对导线分别接百会和肾俞穴,左右侧肾俞交替使用,选用连续波,频率2Hz,电流1mA,以穴位局部微颤为佳,留针20min,每日1次,7日为1疗程,疗程间休息1日,治疗4个疗程共31天;假电针组接电针但不通电;抑制剂组和电针+抑制剂组从第四疗程开始连续7天给予DNA甲基转移酶抑制5-aza-2’-deoxycytidine处理（腹腔注射给药0.2mg/kg/天）。各组小鼠干预结束后,行Morri s水迷宫实验评价各组小鼠的空间学习记忆能力。水迷宫实验结束后进行新鲜海马组织取材和灌注取材并进行指标检测:应用透射电镜观察海马CAI区神经元形态、突触数目、突触超微结构的变化;应用Western-blot检测各组小鼠海马区tau-5、tau-pS262、tau-pS404、PHF-1、CDK5、p25及DNMT1蛋白表达水平;应用免疫组化法观察CDK5的阳性神经元数目;应用荧光定量PCR检测各组小鼠海马区CDK5 mRNA表达水平;应用甲基化特异性PCR检测各组小鼠海马区CDK5 DNA启动子区甲基化水平。结果1.电针对SAMP8小鼠学习记忆能力的影响:（1）各组SAMP8小鼠体征情况观察:正常组毛色亮泽,精神状态好,进食、饮水及对外界刺激反应正常;与正常组相比,模型组小鼠毛色亮泽度稍差,有轻微脱毛和饮食减少,对外界疼痛、声音等刺激反应稍迟钝;与模型组相比,抑制剂组毛色枯黄,脱毛,饮食减少,动作缓慢,对外界刺激反应迟钝,而电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠毛色、精神状态及对外界刺激反应优于模型组,且电针+抑制剂组优于抑制剂组,电针组优于假电针组。（2）各组SAMP8小鼠Morris水迷宫定位航行实验结果:与正常组相比,模型组小鼠平均逃避潜伏期明显延长（P<0.01）;与模型组相比,电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短（P<0.05）,抑制剂组小鼠平均逃避潜伏期明显延长（P<0.05）;与假电针组相比,电针组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短（P<0.05）。（3）各组SAMP8小鼠Morris水迷宫空间探索实验结果:与正常组比较,模型组小鼠首次跨越平台时间明显延长、跨越平台次数明显减少,原平台象限停留时间缩短（P<0.01）;与模型组相比,抑制剂组小鼠首次跨越平台时间明显延长、跨越平台次数明显减少,原平台象限停留时间缩短（P<0.05）,而电针组、假电针组小鼠首次跨越平台时间明显缩短、跨越平台次数明显增加,原平台象限停留时间延长（P<0.01）;与抑制剂组相比,电针+抑制剂组小鼠首次跨越平台时间明显缩短、跨越平台次数明显增加,原平台象限停留时间延长（P<0.05）。（4）各组SAMP8小鼠Morris水迷宫空间辨别能力实验结果:与正常组相比,模型组正确反应次数降低（P<0.01）;与模型组相比,电针组、假电针组正确反应次数增加（P<0.01）;与抑制剂组相比,电针+抑制剂组小鼠正确反应次数增加（P<0.05）,但低于电针组（P<0.05）。2.电针对SAMP8小鼠海马CAⅠ区的神经元和突触的影响:（1）各组小鼠海马CAⅠ区神经元超微结构可见:正常组和电针组神经元形态完整,核和膜结构清晰,可见较多数量的细胞器,内质网、线粒体、溶酶体和高尔基体等形态正常;模型组神经元形态不规则,核和膜结构模糊不清,神经元体积缩小,线粒体数目减少、肿胀并伴随线粒体嵴畸形样改变;抑制剂组神经元形态不规则,核和膜结构模糊不清,神经元体积明显缩小,线粒体数目减少,肿胀并伴随线粒体嵴畸形样改变,内质网、溶酶体和高尔基体等形态均改变。假电针组神经元形态较规则,细胞器数目较电针组减少,胞质水肿严重,胞核固缩,内质网、核糖体及线粒体未见明显异常。电针+抑制剂组形态规则,略有模糊,神经元体积有所减小,线粒体数目较正常有减少等。（2）各组SAMP8小鼠海马CAI区突触数目变化:与正常组相比,模型组单位面积下突触数目减少（P<0.01）;与模型组相比,抑制剂组单位面积下突触数目减少（P<0.05）,而电针组、假电针组、电针+抑制剂组单位面积下突触数目增加（P<0.01或P<0.05）,且假电针组单位面积下突触数目低于电针组（P<0.05）。（3）各组SAMP8小鼠海马CAI区突触后致密带厚度、突触间隙宽度定量分析:与正常组相比,模型组海马CAI区突触后致密带厚度降低、突触间隙宽度略微增宽（P<0.01;P<0.05）;与模型组相比,抑制剂组海马CAI区突触后致密带厚度降低（P<0.05）、突触间隙宽度无显着性差异（P>0.05）,而电针组、假电针组海马CAI区突触后致密带厚度增厚、突触间隙宽度变窄（P<0.01;P<0.05）;与抑制剂组相比,电针+抑制剂组海马CAI区突触后致密带厚度增厚、突触间隙宽度略微变窄（P<0.01;P<0.05）。3.电针对SAMP8小鼠海马区Tau-5及磷酸化位点ser262和ser404的表达水平及PHF-1表达水平的影响:（1）电针对SAMP8小鼠海马区Tau-5蛋白表达水平的影响:与正常组相比,模型组小鼠海马区Tau-5蛋白水平升高（P<0.05）;与模型组相比,抑制剂组小鼠海马区Tau-5蛋白水平升高（P<0.05）,而电针组、假电针组下降（P<0.05）,且假电针组Tau-5蛋白水平下降幅度低于电针组（P<0.05）。（2）电针对SAMP8小鼠海马区磷酸化位点ser262和ser404表达水平的影响:与正常组相比,模型组小鼠海马区磷酸化位点ser262、ser404表达水平升高（P<0.01）;与模型组相比,抑制剂组ser404表达水平升高（P<0.05）,ser262表达水平无显着性差异（P>0.05）,电针组、假电针组ser262、ser404表达水平下降（P<0.05）,且假电针组ser262、s er404表达水平下降幅度小于电针组（P<0.05）;与抑制剂组相比,电针+抑制剂组ser262、ser404表达水平下降（P<0.01）。（3）电针对SAMP8小鼠海马区PHF-1表达水平的影响:与正常组相比,模型组小鼠海马区PHF-1表达水平升高（P<0.01）;与模型组相比,抑制剂组PH F-1相对表达水平无显着性差异（P>0.05）,电针组、假电针组PHF-1相对表达水平下降（P<0.05）,且假电针组下降程度低于电针组（P<0.05）;与抑制剂组相比,电针+抑制剂组PHF-1相对表达水平下降（P<0.01）。4.电针对SAMP8小鼠海马区P25及CDK5蛋白表达水平的影响:（1）电针对SAMP8小鼠海马区P25的影响:与正常组相比,模型组小鼠海马区P25表达增加（P<0.01）;与模型组相比,抑制剂组P25表达水平无明显差异（P>0.05）,而电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠海马区P25表达下降（P<0.01）,且假电针组、电针+抑制剂组下降水平均较电针组低（P<0.05）。（2）电针对SAMP8小鼠海马区CDK5蛋白表达水平的影响:免疫组化结果发现,与正常组相比,模型组小鼠海马区CDK5阳性神经元增多（P<0.05）;与模型组相比,抑制剂组小鼠海马区CDK5阳性神经元增多（P<0.05）,而电针组、假电针组小鼠海马区CDK5阳性神经元减少（P<0.01;P<0.05）;与电针组相比,假电针组小鼠海马区CDK5阳性神经元增多（P<0.01）。WB结果发现,与正常组相比,模型组小鼠海马区CDK5水平升高（P<0.01）;与模型组相比,抑制剂组小鼠海马区CDK5水平升高（P<0.05）,而电针组和假电针组降低（P<0.01;P<0.05）;与电针组相比,假电针组和电针+抑制剂组小鼠海马区CDK5水平升高（P<0.05）;与抑制剂组相比,电针+抑制剂组小鼠海马区CDK5水平降低（P<0.01）。5.电针对SAMP8小鼠海马区DNA甲基转移酶DNMT1、CDK5 DNA启动子区甲基化水平及CDK5 mRNA水平的影响:（1）电针对SAMP8小鼠海马区DNMT1水平的影响:与正常组相比,模型组小鼠海马区DNMT1相对表达水平下降（P<0.01）;与模型组相比,抑制剂组DNMT1相对表达水平略下降（P<0.05）,而电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠海马区DNMT1相对表达水平显着增高（P<0.01或P<0.05）;与电针组相比,假电针组小鼠海马区DNMT1相对表达水平增幅略低（P<0.05）。（2）电针对SAMP8小鼠海马区CDK5 DNA启动子区甲基化水平的影响:与正常组相比,模型组小鼠CDK5 DNA启动子区甲基化水平下降（P<0.01）;与模型组相比,抑制剂组小鼠CDK5 DNA启动子区甲基化水平下降（P<0.05）,而电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠CDK5 DNA启动子区甲基化水平明显升高（P<0.01或P<0.05）,且假电针组、电针+抑制剂组小鼠CDK5 DNA启动子区甲基化水平均低于电针组（P<0.05）。（3）电针对SAMP8小鼠海马区CDK5 mRNA水平的影响:通过荧光定量PCR检测发现,与正常组相比,模型组小鼠海马区组织CDK5 mRNA水平升高（P<0.01）;与模型组相比,抑制剂组小鼠海马区组织CDK5 mRNA水平升高（P<0.05）,而电针组、假电针组小鼠海马区组织CDK5 mRNA水平下降（P<0.01;P<0.05）,且假电针组小鼠海马区组织CDK5 mRNA水平较电针组高（P<0.05）。结论1.电针可改善SAMP8小鼠空间学习记忆能力损伤,通过改善海马区神经元及突触超微结构损伤可能是电针改善SAMP8小鼠学习记忆能力损伤的重要机制之一。2.电针可通过抑制CDK5的过度激活而抑制tau蛋白过度磷酸化,减少神经原纤维缠结的形成,从而减轻神经元和突触超微结构损伤。3.电针可通过上调海马区DNMT1的表达,升高CDK5基因启动子区甲基化水平从而抑制CDK5基因的转录和表达,进而抑制tau蛋白过度磷酸化,可能是电针减轻SAMP8小鼠神经元和突触超微结构损伤,改善学习记忆能力损伤的重要机制之一。
二、老年性痴呆（阿尔茨海默病）β淀粉样蛋白人源抗体的体外筛选和表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、老年性痴呆（阿尔茨海默病）β淀粉样蛋白人源抗体的体外筛选和表达（论文提纲范文）
（1）解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一 AD的病因病机及治疗进展 |
| 1 中医学对痴呆的系统认识及研究进展 |
| 1.1 中医学对痴呆病名由来及发展的认识 |
| 1.2 中医学对痴呆病因病机的古代认识 |
| 1.3 中医学对痴呆辨证论治及相关研究的认识 |
| 1.4 中医学对痴呆治疗的古今认识 |
| 综述二 西医学对AD的发病机制及治疗进展研究 |
| 1 现代医学对AD的认识及研究进展 |
| 1.1 AD的概述及流行病学 |
| 1.2 现代医学对AD发病因素的认识及研究 |
| 1.3 现代医学对AD发病相关机制的认识 |
| 2 现代医学对AD治疗的认识 |
| 2.1 乙酰胆碱酯酶抑制剂(AchEIs) |
| 2.2 兴奋性氨基酸受体拮抗剂 |
| 2.3 甘露特纳胶囊 |
| 2.4 其他非药物治疗 |
| 3 问题与展望 |
| 综述三 Aβ在脑内异常沉积的机制 |
| 1.Aβ的产生、分布与清除、传递与运输的研究进展 |
| 1.1 Aβ的产生 |
| 2 Aβ的清除 |
| 2.1 细胞的清除作用 |
| 2.2 Aβ被降解酶的清除作用 |
| 2.3 中枢Aβ的清除途径 |
| 2.4 血液成分介导的Aβ清除 |
| 综述四 解毒益智方在阿尔茨海默病中的应用 |
| 1 解毒益智方的创立 |
| 1.1 脑髓理论 |
| 1.2 髓虚毒损 |
| 1.3 补肾益髓,活血化痰解毒法 |
| 2 解毒益智方通过调节SIRT1/AMPK通路抑制BACE1表达改善Aβ的沉积 |
| 3 解毒益智方对阿尔茨海默病的临床应用 |
| 实验研究 |
| 第一章 CCP对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤保护性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠行为学的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ水平变化的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 JDYZF对APP/PS1双转基因小鼠脑内BACE1表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（2）黄连解毒汤治疗阿尔茨海默病的临床观察及实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 研究概况 |
| 1.现代医学对AD的认识 |
| 1.1 AD的临床诊断 |
| 1.2 AD发病机制的研究进展 |
| 1.3 AD的临床药物治疗与新药研发 |
| 2.中医学对AD的认识 |
| 2.1 AD的中医病因病机 |
| 2.2 AD的毒损脑络理论 |
| 2.3 AD的中药治疗方案 |
| 3.黄连解毒汤治疗AD |
| 3.1 黄连解毒汤对AD的临床疗效 |
| 3.2 黄连解毒汤治疗AD的可能性机制 |
| 第二部分 黄连解毒汤治疗AD的临床观察 |
| 1.临床资料 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 剔除标准 |
| 1.6 脱落标准 |
| 1.7 中止试验标准 |
| 2.方法 |
| 2.1 治疗方案 |
| 2.2 观察方法和评价指标 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 患者招募完成情况 |
| 3.2 基线资料 |
| 3.3 两组各时间点疗效指标比较 |
| 3.4 两组疗效的维持效应 |
| 3.5 中医证候要素与认知功能、日常生活活动能力、生活质量的相关性 |
| 3.6 黄连解毒汤对中医证候的影响 |
| 3.7 安全性观察 |
| 3.8 依从性观察 |
| 4.讨论 |
| 4.1 黄连解毒汤治疗AD的临床依据 |
| 4.2 黄连解毒汤的临床疗效分析 |
| 4.3 中医证候与整体认知功能、日常生活活动能力、生活质量的相关性 |
| 4.4 黄连解毒汤对AD患者的中医证候的影响 |
| 4.5 黄连解毒汤的安全性评价及依从性评价 |
| 5.小结 |
| 第三部分 黄连解毒汤干预AD模型小鼠的实验研究 |
| 实验一 黄连解毒汤对AD模型小鼠学习记忆能力的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验动物及饲养环境 |
| 1.2 实验主要药物 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计方法 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 定位航行实验结果 |
| 2.2 空间探索实验结果 |
| 3.讨论 |
| 3.1 动物模型与水迷宫检测选择依据 |
| 3.2 黄连解毒汤对Tau/APP/PS1三转基因小鼠学习记忆的影响 |
| 4.小结 |
| 实验二 黄连解毒汤对AD模型小鼠海马组织Aβ及相关炎性因子表达的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验主要仪器 |
| 1.2 实验主要试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 黄连解毒汤对AD小鼠海马组织Aβ1-40及Aβ1-42 水平的影响 |
| 2.2 黄连解毒汤对AD小鼠海马组织IL-1β、IL-18表达的影响 |
| 3.讨论 |
| 3.1 黄连解毒汤对AD小鼠海马组织Aβ水平的影响 |
| 3.2 黄连解毒汤对AD小鼠海马组织IL-1β、IL-18 的影响 |
| 4.小结 |
| 实验三 黄连解毒汤对AD模型小鼠海马组织形态学及小胶质细胞活化情况的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验动物、分组、干预方法 |
| 1.4 标本制备 |
| 1.5 苏木素-伊红(HE)染色的主要操作步骤 |
| 1.6 免疫组化(IHC)方法的主要操作步骤 |
| 1.7 统计分析方法 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 HE染色观察五组小鼠海马CA1区组织形态 |
| 2.2 免疫组化观察五组小鼠海马CA1区小胶质细胞活化情况 |
| 3.讨论 |
| 3.1 黄连解毒汤对AD小鼠海马组织形态的保护作用 |
| 3.2 黄连解毒汤对AD小鼠海马小胶质细胞活化的调节作用 |
| 4.小结 |
| 实验四 黄连解毒汤对AD模型小鼠海马NLRP3 炎性小体相关蛋白及mRNA表达的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要仪器与设备 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验动物、分组、干预方法 |
| 1.4 标本制备 |
| 1.5 指标检测 |
| 1.6 统计方法 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 黄连解毒汤对AD小鼠海马组织NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Caspase-1 p20蛋白表达的影响 |
| 2.2 黄连解毒汤对AD小鼠海马组织NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表达的影响 |
| 3.讨论 |
| 3.1 NLRP3/ASC/Caspase-1在AD病理机制中的作用 |
| 3.2 黄连解毒汤对Tau/APP/PS1小鼠海马NLRP3炎性小体相关蛋白及mRNA表达的影响 |
| 4.小结 |
| 第四部分 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 小胶质细胞与NLRP3炎性小体在阿尔茨海默病病理过程中的作用 |
| 参考文献 |
| 在校期间公开发表的学术论文及科研成果 |
| 致谢 |
（3）基于氧化应激反应探讨阿里红多糖抗阿尔茨海默病的作用及机制（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 阿里红多糖对阿尔茨海默病模型大鼠抗氧化应激损伤机制的研究 |
| 1.1 实验仪器与材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2 阿里红多糖对H_2O_2诱导HT22 细胞氧化损伤的保护作用 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 氧化应激和 Nrf2/ARE 通路在阿尔茨海默病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（4）二苯乙烯苷对APP/PS1/Tau三转基因小鼠Tau蛋白异常磷酸化的干预及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要实验仪器 |
| 1.1.3 主要药物及生化试剂 |
| 1.1.4 实验药物配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物分组及给药 |
| 1.2.2 行为学检测 |
| 1.2.3 标本取材 |
| 1.2.4 尼氏染色实验 |
| 1.2.5 免疫组织化学染色实验 |
| 1.2.6 免疫荧光染色实验 |
| 1.2.7 实时定量反转录聚合酶链式反应方法 |
| 1.2.8 蛋白印迹实验 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 行为学检测结果 |
| 2.1.1 定位航行训练 |
| 2.1.2 空间探索实验 |
| 2.2 病理检测结果 |
| 2.2.1 脑皮层、海马尼氏染色结果 |
| 2.2.2 脑组织P39 免疫组织化学染色结果及分析 |
| 2.2.3 脑组织Tau 蛋白、磷酸化Tau 蛋白(Ser404 位点)IF染色结果及分析 |
| 2.3 实时定量反转录聚合酶链式反应方法检测结果 |
| 2.3.1 总RNA纯度分析 |
| 2.3.2 扩增曲线和溶解曲线分析 |
| 2.3.3 脑组织蛋白激酶CDK5、ERK1/2、JNK mRNA转录结果 |
| 2.3.4 脑组织蛋白磷酸酶PP2B、PP1 mRNA转录结果 |
| 2.4 蛋白印迹检测结果 |
| 2.4.1 脑组织磷酸化Tau蛋白(Thr205 位点)表达结果 |
| 2.4.2 脑组织蛋白激酶CDK5、ERK1/2、JNK蛋白表达结果 |
| 2.4.3 脑组织蛋白磷酸酶PP2B、PP1 蛋白表达结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 3×Tg-AD小鼠的选择 |
| 3.2 阳性对照药物石杉碱甲的选择 |
| 3.3 各项指标在实验中测定的意义 |
| 3.3.1 TSG对3×Tg-AD小鼠学习记忆能力的影响 |
| 3.3.2 TSG对3×Tg-AD小鼠皮层、海马区病理学形态结构的影响 |
| 3.3.3 TSG对3×Tg-AD小鼠脑Tau蛋白磷酸化(Thr205、Ser404 位点)的影响 |
| 3.3.4 TSG对3×Tg-AD小鼠脑Tau蛋白磷酸化相关蛋白激酶的影响 |
| 3.3.5 TSG对3×Tg-AD小鼠脑Tau蛋白去磷酸化相关蛋白磷酸酶的影响 |
| 3.3.6 TSG对3×Tg-AD小鼠脑Tau蛋白磷酸化相关蛋白激酶调控因子P39 的影响 |
| 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 以Tau蛋白过度磷酸化为靶点治疗阿尔茨海默病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（5）黄连解毒汤含药脑脊液对Aβ1-42致BV2细胞凋亡及炎症反应的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 阿尔茨海默病概述 |
| 1.1 阿尔茨海默病发病机制假说 |
| 1.2 Aβ沉积与阿尔茨海默病 |
| 1.3 小胶质细胞与阿尔茨海默病 |
| 1.3.1 小胶质细胞对脑稳态的保护作用 |
| 1.3.2 小胶质细胞通过表面受体响应吞噬功能 |
| 1.3.3 小胶质细胞过度激活与凋亡促进神经炎症 |
| 2 中医对阿尔茨海默病的认识 |
| 3 阿尔茨海默病治疗现状 |
| 3.1 胆碱酯酶抑制剂 |
| 3.2 抑制Aβ蛋白沉积药物 |
| 3.3 N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂 |
| 3.4 钙离子拮抗剂 |
| 3.5 抗氧化药物 |
| 3.6 非甾体抗炎药物 |
| 3.7 靶向小胶质细胞治疗 |
| 4 黄连解毒汤治疗阿尔茨海默病的研究基础 |
| 实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物与细胞 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器及耗材 |
| 1.5 实验试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 寡聚体Aβ_(1-42)淀粉样蛋白孵育 |
| 2.2 黄连解毒汤含药脑脊液脑脊液制备 |
| 2.2.1 动物分组与给药 |
| 2.2.2 制备含药脑脊液 |
| 2.3 小胶质细胞培养 |
| 2.3.1 细胞换液 |
| 2.3.2 细胞传代 |
| 2.3.3 细胞冻存 |
| 2.3.4 细胞复苏 |
| 2.4 实验检测 |
| 2.4.1 MTT法测定不同浓度寡聚体Aβ_(1-42)致BV2 细胞损伤的影响 |
| 2.4.2 Annexin V-FITC/PI双染法检测小胶质细胞凋亡 |
| 2.4.2.1 寡聚体Aβ_(1-42)诱导小胶质细胞凋亡浓度确定 |
| 2.4.2.2 流式细胞术检测黄连解毒汤对寡聚体Aβ_(1-42)致小胶质细胞凋亡率影响 |
| 2.4.3 Western Blot检测黄连解毒汤对寡聚体Aβ_(1-42)诱导的小胶质细胞Cleave Caspase-3、Arg-1与i NOS蛋白表达水平影响 |
| 2.4.3.1 小胶质细胞蛋白提取 |
| 2.4.3.2 BCA蛋白定量检测与蛋白变性 |
| 2.4.3.3 Western blot免疫印迹法检BV2 细胞Cleave Caspase-3、Arg-1与i NOS蛋白的表达 |
| 2.4.4 黄连解毒汤含药脑脊液对寡聚体Aβ_(1-42)诱导的小胶质细胞炎性因子IFN-γ、IL-6、IL-10 表达的影响 |
| 3 统计学分析方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 不同浓度寡聚体Aβ_(1-42)作用于BV2细胞毒性作用观察 |
| 4.2 黄连解毒汤含药脑脊液对Aβ_(1-42)致BV2细胞凋亡的影响 |
| 4.2.1 寡聚体Aβ_(1-42)诱导小胶质细胞凋亡浓度确定 |
| 4.2.2 黄连解毒汤对寡聚体Aβ_(1-42)致小胶质细胞凋亡影响 |
| 4.3 黄连解毒汤对寡聚体Aβ_(1-42)诱导的小胶质细胞Cleaved Caspase-3、Arg-1与i NOS蛋白表达水平影响 |
| 4.4 黄连解毒汤含药脑脊液对寡聚体Aβ_(1-42)诱导的小胶质细胞炎性因子IFN-γ、IL-6、IL-10表达的影响 |
| 讨论 |
| 1 AΒ沉积与细胞凋亡 |
| 1.1 细胞凋亡与AD |
| 1.2 Aβ诱导细胞凋亡 |
| 2 神经炎症是阿尔茨海默病的重要发病机制 |
| 3 小胶质细胞凋亡加重AΒ沉积与神经炎症 |
| 4 黄连解毒汤可以通过抑制小胶质细胞凋亡调控小胶质细胞极化改善神经炎症 |
| 5 “毒损脑络”理论与黄连解毒汤在AD中的运用 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 从“毒损脑络”探讨小胶质细胞在阿尔茨海默病发病中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着、及科研成果 |
（6）靶向重组Hsp90α亲和性多肽库筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 重组质粒pGEX-6P-1/Hsp90α的构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 PCR扩增基因片段 |
| 1.2.3 双酶切和酶连 |
| 1.2.4 酶连产物转入大肠杆菌DH5α |
| 1.3 实验结果 |
| 第二章 重组质粒pGEX-6P-1/Hsp90α的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组质粒pGEX-6P-1/Hsp90α转化至表达菌BL21 |
| 2.2.2 考马斯亮蓝染色和Western Blotting检测GST-Hsp90α融合蛋白 |
| 2.2.3 纯化、透析和浓缩GST-Hsp90α融合蛋白 |
| 2.3 实验结果 |
| 第三章 利用噬菌体展示肽库技术筛选Hsp90α亲和肽 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 培养基和溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 固相法亲和筛选 |
| 3.2.2 扩增噬菌体 |
| 3.2.3 测定噬菌体滴度 |
| 3.2.4 测定阳性噬菌体克隆DNA序列和分析多肽序列 |
| 3.2.5 ELISA鉴定噬菌体克隆与Hsp90α的亲和性 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 筛选亲和Hsp90α的噬菌体 |
| 3.3.2 噬菌体克隆插入DNA序列测定及氨基酸序列分析 |
| 3.3.3 ELASA鉴定亲和Hsp90α的阳性噬菌体 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 HSP90抑制剂作为阿尔茨海默病潜在的治疗靶点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及获得荣誉 |
（7）基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨参枝苓口服液对AD的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述一“从心论治”阿尔茨海默病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 PI3K/Akt及其相关信号通路在AD中研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 参枝苓口服液对APP~(swe)/PS1~(dE9)双转基因AD模型小鼠认知行为及髓鞘的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 参枝苓口服液对Aβ_(42)致少突胶质细胞OLN-93损伤的保护作用机制 |
| 参考文献 |
| 实验一 UHPLC-MRM-MS/MS方法检测参枝苓口服液含药血清主要化学成分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 Aβ_(42)损伤少突胶质细胞OLN-93拟AD体外模型的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 参枝苓口服液含药血清及多奈哌齐对OLN-93细胞安全剂量及有效剂量筛选 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 参枝苓口服液含药血清对Aβ_(42)损伤OLN-93细胞髓鞘相关蛋白及PI3K/Akt-mTOR通路的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 参枝苓口服液对Aβ_(42)损伤少突胶质细胞OLN-93的乙酰化组蛋白与MBP基因相互作用影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 参枝苓口服液对Aβ_(42)损伤少突胶质细胞OLN-93脂质代谢的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 存在问题和不足 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（8）龟龄集对AD认知功能的疗效评价及突触和髓鞘相关作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 从肾论治阿尔茨海默病中医研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 BDNF在阿尔茨海默病中的作用 |
| 参考文献 |
| 第一章 龟龄集对AD认知功能的疗效评价 |
| 前言 |
| 一、研究对象与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 病例选择 |
| 3 研究方法 |
| 二、研究结果 |
| 1 纳入病例情况 |
| 2 基线资料分析 |
| 3 治疗后疗效比较 |
| 4 安全性和不良反应分析 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 龟龄集对SAMP8小鼠认知功能的影响及机制研究 |
| 一、材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 二、研究结果 |
| 1 新物体识别实验检测龟龄集对SAMP8小鼠识别记忆能力的影响 |
| 2 Morris水迷宫检测龟龄集对SAMP8小鼠空间学习记忆能力的影响 |
| 3 龟龄集对SAMP8小鼠海马病理形态的影响 |
| 4 龟龄集对SAMP8小鼠突触、髓鞘相关蛋白的影响 |
| 5 龟龄集对SAMP8小鼠海马BDNF/TrkB信号通路的影响 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（9）益气健脾法改善脾气虚证认知障碍大鼠炎症和过氧化损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 阿尔茨海默病发病机制的中西医研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（10）基于CDK5 DNA甲基化研究电针对SAMP8小鼠海马区Tau蛋白磷酸化的影响及作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 电针干预对SAMP8 小鼠行为学的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验动物及饲养 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 模型筛选 |
| 1.5 实验分组 |
| 1.6 实验干预 |
| 1.7 试验技术路线图 |
| 1.8 Morris水迷宫试验 |
| 1.9 观察指标 |
| 1.10 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 各组SAMP8 小鼠行为学观察 |
| 2.2 各组SAMP8 小鼠定位航行试验(place navigation)结果 |
| 2.3 各组SAMP8 小鼠空间探索实验(spatial probe test)结果 |
| 2.4 各组SAMP8 小鼠空间辨别能力实验(spatial discriminability)结果 |
| 3.讨论 |
| 实验二 电针干预对SAMP8 小鼠海马CAI区突触形态学和数目的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验动物及饲养 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 模型制作与筛选 |
| 1.5 实验分组 |
| 1.6 实验干预 |
| 1.7 灌注与取材 |
| 1.8 透射电镜样品制作 |
| 1.9 透射电镜观察 |
| 1.10 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 各组SAMP8 小鼠海马CAI区神经元突触形态的观察 |
| 2.2 各组SAMP8 小鼠海马CAI区突触数目定量分析 |
| 2.3 各组SAMP8 小鼠海马CAI区突触后致密带厚度、突触间隙宽度定量分析 |
| 3.讨论 |
| 实验三 电针对SAMP8 小鼠海马区Tau-5 及其磷酸化位点ser262 和ser404 的表达水平及PHF-1 表达水平的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验动物及饲养 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 模型制作与筛选 |
| 1.5 实验分组 |
| 1.6 实验干预 |
| 1.7 取材 |
| 1.8 Western Blot检测实验步骤 |
| 1.9 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 电针对SAMP8 小鼠海马区Tau-5 蛋白表达水平的影响 |
| 2.2 电针对SAMP8 小鼠海马区Tau-5 蛋白的磷酸化位点ser262 和ser404 表达水平的影响 |
| 2.3 电针对SAMP8 小鼠海马区神经原纤维缠结的主要成分PHF-1表达水平的影响 |
| 3.讨论 |
| 实验四 电针对SAMP8 小鼠海马区P25及CDK5 蛋白表达水平的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验动物及饲养 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 模型制作与筛选 |
| 1.5 实验分组 |
| 1.6 实验干预 |
| 1.7 取材 |
| 1.8 实验操作 |
| 1.9 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 电针对SAMP8 小鼠海马区P25 的影响 |
| 2.2 电针对SAMP8 小鼠海马区CDK5 蛋白表达水平的影响 |
| 3.讨论 |
| 实验五 电针对SAMP8 小鼠海马区DNA甲基转移酶DNMT1、CDK5 DNA启动子区甲基化水平及CDK5 mRNA水平的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 实验动物及饲养 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 模型制作与筛选 |
| 1.5 实验分组 |
| 1.6 实验干预 |
| 1.7 取材 |
| 1.8 实验步骤 |
| 1.9 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 电针对SAMP8 小鼠海马区DNA甲基转移酶DNMT1、CDK5 DNA启动子区甲基化水平的影响 |
| 2.2 电针对SAMP8 小鼠海马区CDK5 mRNA水平的影响 |
| 3.讨论 |
| 讨论 |
| 1.阿尔茨海默症的中医认识及针灸治疗 |
| 1.1 阿尔茨海默症的中医认识 |
| 1.2 阿尔茨海默症的针灸治疗 |
| 2.阿尔茨海默症的西医病理及治疗 |
| 3.Tau磷酸化与AD |
| 4.CDK5 DNA甲基化与Tau磷酸化 |
| 5.电针干预AD的机制探讨 |
| 5.1 电针通过抑制tau蛋白磷酸化干预AD |
| 5.2 电针通过抑制CDK5 DNA甲基化水平干预AD |
| 6.创新点 |
| 7.问题与展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录一 文献综述 阿尔茨海默病的治疗研究进展及方向 |
| 1.阿尔茨海默病的中医药治疗研究进展 |
| 2.西医常规治疗研究进展 |
| 3.靶向治疗研究进展 |
| 4.特殊治疗研究进展 |
| 5.未来方向 |
| 参考文献 |
| 附录二 博士期间发表论文及参与课题 |
| 致谢 |
四、老年性痴呆（阿尔茨海默病）β淀粉样蛋白人源抗体的体外筛选和表达（论文参考文献）
- [1]解毒益智方对阿尔茨海默病双转基因小鼠行为学及大脑皮层内β-淀粉样蛋白沉积及BACE1表达影响的研究[D]. 朱晓婷. 长春中医药大学, 2021(01)
- [2]黄连解毒汤治疗阿尔茨海默病的临床观察及实验研究[D]. 高炎. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [3]基于氧化应激反应探讨阿里红多糖抗阿尔茨海默病的作用及机制[D]. 苏丽燕·赛力木江. 新疆医科大学, 2021
- [4]二苯乙烯苷对APP/PS1/Tau三转基因小鼠Tau蛋白异常磷酸化的干预及机制研究[D]. 吴文雪. 右江民族医学院, 2020
- [5]黄连解毒汤含药脑脊液对Aβ1-42致BV2细胞凋亡及炎症反应的机制研究[D]. 彭红梅. 成都中医药大学, 2020(02)
- [6]靶向重组Hsp90α亲和性多肽库筛选[D]. 李素华. 河南大学, 2020(02)
- [7]基于髓鞘及少突胶质细胞损伤探讨参枝苓口服液对AD的保护作用[D]. 刘珍洪. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]龟龄集对AD认知功能的疗效评价及突触和髓鞘相关作用研究[D]. 王慧婵. 北京中医药大学, 2020(04)
- [9]益气健脾法改善脾气虚证认知障碍大鼠炎症和过氧化损伤的实验研究[D]. 张耀尹. 辽宁中医药大学, 2020(02)
- [10]基于CDK5 DNA甲基化研究电针对SAMP8小鼠海马区Tau蛋白磷酸化的影响及作用机制[D]. 马冉. 湖北中医药大学, 2020(08)