不同反应体系中黑根霉催化甾体C11α-羟基化的研究

论文摘要

本论文研究了黑根霉（Rhizopus nigricans）生物催化甾体的C11α羟基化反应。考察了水相发酵体系下转化条件对黑根霉转化效果的影响,重点构建了一个适合黑根霉生物催化甾体C11α-羟基化的两相体系以及研究了固定化技术在两相发酵体系中的应用。对比了黑根霉对三种甾体底物转化能力的差异。首先,研究了水相培养条件对黑根霉菌体生长状态的影响,同时对比了不同菌体形态对转化效率的差别,发现带有绒毛状菌丝的菌球转化效果最好。成球条件为孢子接种浓度为107个孢子/mL,发酵温度28℃,转速为150r/min。从发酵过程曲线和转化过程来看,前8h为延滞期,9-22h为对数生长期,在第22h发酵液pH降到了3.8,溶氧降到10%,菌体培养成熟,此时为投入底物的最佳时期,转化的第44h为转化终止时间。而250mL三角瓶装液量为50mL,投料浓度为2%,转化pH4.6为最佳的转化条件。水相发酵体系下的羟化酶诱导实验确定了0.2%的底物诱导浓度,诱导菌龄为16h,诱导时长为8h。从助溶剂和表面活性剂角度看,吐温-80的效果最好,底物经吐温-80处理后最终转化率比对照提高了18%,甲醇的效果比乙醇好,甲醇的最佳添加量为4%。其次,重点研究了两相转化体系的建立。从有机溶剂的对甾体的溶解度、对黑根霉细胞的毒性和最终的转化效果来看,乙酸丁酯是作为有机相的最佳选择。优化了此体系的最佳转化条件,乙酸丁酯相与发酵液相的体积比为1：5,最适转化温度为25℃。而从不同的水相对比来看,发酵液比缓冲液和无菌水的效果都好。之后考察了氧促进剂H2O2和外电子受体维生素K3对C11α-羟基化转化率的影响方面,前者的最佳添加量为1%,比对照体系转化率提高了8%；后者的最佳添加量为0.1%,比对照体系转化率提高了6%。从底物的角度看,黑根霉催化16α,17α-环氧黄体酮11α羟基化的效率最高。最后,研究了固定化细胞在两相体系中的应用。从选择的3种固定化方法来看,海藻酸钙包埋法的效果最好。虽然转化率并没有比游离体系有所提高,但是酶活回收率却明显增加,有利于转化体系的重复利用,而且提高了黑根霉细胞对有机溶剂的耐受性,增加了羟基化反应的初始速率。黑根霉细胞经海藻酸钙固定化后最终产品的提取工艺大大简化,所用仪器及试剂均有所减少。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 甾体化合物概述
• 1.1.1 甾体化合物性质及基本结构
• 1.1.2 甾体化合物的分类及功效
• 1.2 甾体化合物的微生物转化
• 1.2.1 甾体化合物微生物转化的特点及转化方法
• 1.2.2 甾体化合物微生物转化的作用位点及类型
• 1.2.3 甾体化合物微生物转化的研究进展
• 1.2.4 甾体化合物微生物转化现状
• 1.2.5 甾体化合物微生物转化所面临的难题
• 1.3 两相发酵在甾体微生物转化中的应用
• 1.3.1 两相体系中生物转化的特点
• 1.3.2 两相体系中生物转化的研究进展
• 1.3.3 两相体系中有机相的选择
• 1.3.4 两相体系中有机相/水相的比例
• 1.3.5 两相体系中添加氧促进剂对生物转化的影响
• 1.3.6 两相体系中添加外电子受体对生物转化的影响
• 1.4 黑根霉催化甾体C11α-羟基化反应
• 1.4.1 甾体C11α-羟基化概述
• 1.4.2 羟基化反应原理
• 1.4.3 黑根霉的性状及其催化甾体的C11 α-羟基化
• 1.5 本论文研究内容及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验菌种
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种活化
• 2.2.2 细胞干重法测定黑根霉发酵培养的生物量
• 2.2.3 摇瓶培养及转化工艺
• 2.2.4 7L发酵罐培养及转化工艺
• 2.2.5 甾体底物处理方法
• 2.2.6 羟化酶诱导实验
• 2.2.7 两相转化体系的建立
• 2.2.8 两相转化体系的改进
• 2.2.9 固定化黑根霉细胞
• 2.2.10 样品的测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 水相体系下黑根霉催化甾体的C11 α-羟基化
• 3.1.1 接种量,发酵温度及摇瓶转速对菌体形态的影响
• 3.1.2 菌体形态对转化的影响
• 3.1.3 黑根霉发酵培养曲线
• 3.1.4 摇瓶不同装液量对转化率影响的测定
• 3.1.5 不同投料浓度对转化的影响
• 3.1.6 pH对转化的影响
• 3.1.7 羟化酶诱导实验
• 3.1.8 助溶剂和表面活性剂对转化的影响
• 3.1.9 7L发酵罐转化过程曲线
• 3.1.10 水相体系下黑根霉催化三种甾体底物的差异
• 3.2 两相体系下黑根霉催化甾体C11α-羟基化
• 3.2.1 分光光度法甾体溶解度的测定
• 3.2.2 有机溶剂对细胞的毒性对比
• 3.2.3 不同有机相对于11α-羟基化转化率的影响
• 3.2.4 乙酸丁酯/发酵液两相体系下的转化条件的研究
• 3.3 固定化黑根霉催化甾体C11α-羟基化
• 3.3.1 固定化细胞技术在生物转化中的应用
• 3.3.2 三种固定化黑根霉细胞细胞对转化的差异
• 3.3.3 海藻酸钙包埋法固定化/乙酸丁酯体系
• 3.4 产物提取
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢