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甲壳类C-型凝集素的功能研究

2020-12-11阅读(469)

甲壳类C-型凝集素的功能研究

论文摘要

无脊椎动物缺少传统意义上的适应性免疫,但是具有快速高效的先天免疫系统,用来防御微生物的侵袭。由于病原微生物表面具有较为保守的病原相关分子模式（pathogen-associated molecule patterns, PAMPs）,所以无脊椎动物的模式识别蛋白（pattern recognition receptors, PRRs）可通过PAMPs识别病原体并启动免疫反应。迄今为止,已经发现很多无脊椎动物的模式识别受体,本论文以中国明对虾和克氏原螯虾为材料,研究甲壳动物的一类模式识别受体：C-型凝集素,得到了如下结果：1.中国明对虾C-型凝集素Fc-Lec2的基因克隆与功能研究我们从中国明对虾肝胰腺克隆得到一种C-型凝集素Fc-Lec2。其cDNA全长1219bp,含有一个1002bp的开放阅读框,编码333个氨基酸。Fc-Lec2含有一个信号肽和两个不同的糖识别结构域（carbohydrate recognition domains, CRDs）, CRD1含半乳糖特异性结合位点（QPD）, CRD2则含甘露糖特异性位点（EPN）。Fc-Lec2主要在肝胰腺中表达,并且鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和白斑综合症病毒（white spot syndrome virus, WSSV）的刺激会引起其上调表达。重组表达的成熟肽蛋白Fc-Lec2和两个单独的结构域不能够凝集细菌,但是能够在钙离子存在下凝集多种革兰氏阳性菌和阴性菌。他们对于细菌的结合则不需要钙离子的参与。全长蛋白Fc-Lec2和单独结构域相比,对于细菌和多糖的结合范围更广,结合活力更强。说明了具有双结构域C-型凝集素的两个CRD具有一定的协同作用,这些数据说明与单结构域的相比,双结构域的Fc-Lec2作为一个模式识别受体,通过结合细菌表面的多糖参与先天识别,从而启动对细菌感染进行免疫防御。2.克氏原螯虾C-型凝集素PcLecl的基因克隆与功能研究我们克隆得到一种新的来自克氏原螯虾的C-型凝集素,将其命名为PcLecl并对其功能做了系统性的研究。该C-型凝集素cDNA的开放阅读框共编码163个氨基酸,其中包括一段长度为17个氨基酸的信号肽以及紧随其后的一个糖识别结构域。在正常螯虾的众多组织中,PcLecl均有表达,但主要集中于肝胰腺和鳃中。PcLecl的表达水平在受到病原细菌如鳗弧菌和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的刺激之后均呈现上调趋势,在受到白斑综合症病毒的刺激之后,其表达水平在随后的72小时依然不断上升。重组PcLecl蛋白可以结合病原菌表面的多糖（肽聚糖peptidoglycan,脂磷壁酸lipoteichoic acid以及脂多糖lipopolysaccharide）以及八种革兰氏阳性菌和阴性菌。但是对于病原细菌没有明显的凝集作用。PcLecl可促进血细胞对于琼脂糖凝胶小珠（sepharose beads）的包被,而重组PcLecl蛋白的多克隆抗体对于包被具有明显的抑制作用。PcLecl可促进螯虾体内对于侵入的鳗弧菌的清除。这些结果表明PcLecl作为一种模式识别受体参与细胞免疫,并以调理素的角色促进细胞对于病原的包被和清除作用。2.克氏原螯虾含IG结构域的C-型凝集素（PcLec3）的基因克隆与功能研究我们对于一种来自于克氏原螯虾的C-型凝集素进行了研究,这种被命名为PcLec3的C-型凝集素cDNA的开放阅读框共编码252个氨基酸残基,其中包括一段长度为20个氨基酸残基的信号肽,一个Ig结构域以及一个糖识别结构域。该凝集素在血细胞和肝胰腺中特异性表达,鳗弧菌刺激后,会引起肝胰腺中PcLec3上调表达。我们分别表达了PcLec3全长,IG结构域以及糖识别结构域三个部分的重组蛋白,并对全长以及两个结构域的功能进行了系统性和比较性的探究。发现这三种蛋白无论全长还是单独的结构域,均具有多糖结合活性以及细菌结合活性。作为含有IG家族的凝集素,PcLec3具有细胞粘附分子的特征,并在血细胞对病原菌吞噬的过程中具有很强的促进能力。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 第一章 无脊椎动物先天免疫与模式识别受体
  • 一、无脊椎动物先天免疫简介
  • 1. 细胞免疫
  • 2. 体液免疫
  • 2.1. 血淋巴凝集
  • 2.2. 酚氧化酶原系统的激活
  • 2.3. 抗菌肽的产生
  • 二、模式识别蛋白（PRRs）
  • 1. 肽聚糖识别蛋白（PGRPs）
  • 2. Toll样受体（TLRs）
  • 3. 革兰氏阴性菌结合蛋白（GNBPs）
  • 4. 清道夫受体（SCRs）
  • 5. 含硫脂键蛋白（TEP）
  • 6. 唐氏综合症细胞粘附分子（DSCAM）
  • 7. 半乳糖苷结合凝集素（Galectins）
  • 8. 纤维蛋白原样结构域免疫凝集素（FBGLs）
  • 9. C-型凝集素（CTLs）
  • 第二章 C-型凝集素的结构与功能多样性
  • 一、引言
  • 二、C-型凝集素的定义及特征
  • 三、C-型凝集素的结构
  • 四、C-型凝集素的种类多样性
  • 五、C-型凝集素的功能
  • 1. 哺乳动物C-型凝集素的功能
  • 2. 无脊椎动物中C-型凝集素的功能
  • 六、本论文的研究目的和技术路线
  • 第三章 中国明对虾Fc-Lec2的两个结构域协同参与先天免疫应答
  • 一、前言
  • 二、材料和方法
  • 1. 菌株和载体
  • 2. 仪器和试剂
  • 3. 实验材料
  • 4. 总mRNA的提取和cDNA的合成
  • 4.1. 总mRNA的提取
  • 4.2. 合成cDNA
  • 5. 中国明对虾Fc-Lec2基因的扩增
  • 5.1. PCR扩增
  • 5.2. 胶回收
  • 5.3. 连接
  • 5.4. 转化
  • 5.5. 筛选
  • 5.6. 提取阳性克隆重组质粒
  • 5.7. 重组质粒的PCR和双酶切验证
  • 6. 序列分析
  • 7. 组织分布和刺激后表达模式分析
  • 8. 蛋白重组表达,纯化及抗体制备
  • 8.1. 构建重组质粒和转化表达菌株
  • 8.2. 蛋白试表达
  • 8.3. 检测重组表达的蛋白是否形成包涵体
  • 8.4. 蛋白大规模表达
  • 8.5. 包涵体变性复性
  • 8.6. 蛋白的亲和纯化
  • 8.7. 多克隆抗体制备
  • 9. Western blot法检测重组蛋白
  • 10. Western blot法检测组织分布
  • 11. 免疫组织化学法定位蛋白分布
  • 11.1. 载玻片清洗
  • 11.2. 切片与贴片
  • 11.3. 抗体反应
  • 12. 细菌结合
  • 12.1. 细菌结合实验
  • 12.2. 糖抑制细菌结合实验
  • 13. 凝集实验
  • 13.1. 兔血细胞凝集实验
  • 13.2. 细菌凝集实验
  • 14. 糖的抑制凝集作用实验
  • 15. 蛋白与糖的直接结合实验
  • 三、结果
  • 1. 基因克隆和序列分析
  • 2. Fc-Lec2的组织分布和表达模式
  • 3. Fc-Lec2与结构域的重组表达及纯化
  • 4. 对虾体内Fc-Lec2的蛋白表达
  • 5. Fc-Lec2的细菌结合活性
  • 6. Fc-Lec2的细菌凝集活性
  • 7. Fc-Lec2的糖特异性
  • 四、讨论
  • 第四章 克氏原螯虾C-型凝集素PcLec1参与细胞免疫反应
  • 一、前言
  • 二、材料和方法
  • 1. 菌株和载体
  • 2. 仪器和试剂
  • 3. 实验材料
  • 4. 总mRNA的提取和cDNA的合成
  • 5. 克氏原螯虾PcLec1基因的扩增
  • 6. 序列分析
  • 7. mRNA组织分布和刺激后表达模式
  • 8. 蛋白重组表达,纯化及抗体制备
  • 9. Western blot法检测组织分布
  • 10. 细菌凝集
  • 11. 细菌结合
  • 12. 蛋白与糖的直接结合实验
  • 13. 体外促进血细胞包被实验
  • 13.1. 偶联PcLec1到凝胶小珠
  • 13.2. 检测偶联
  • 13.3. 血细胞对小珠的包被
  • 14. 体内清除实验
  • 三、结果
  • 1. 克隆并得到PcLec1的cDNA全长
  • 2. PcLec1的序列分析
  • 3. PcLec1表达模式
  • 4. 重组PcLec1蛋白的表达与纯化
  • 5. 蛋白免疫印迹法检测在螯虾不同组织中PcLec1蛋白的表达水平
  • 6. 重组PcLec1蛋白的细菌结合实验与细菌凝集实验
  • 7. 重组PcLec1蛋白的糖结合曲线
  • 8. 重组PcLec1蛋白可促进血细胞的包被（Encapsulation）
  • 9. 重组PcLec1蛋白参与细菌清除作用
  • 四、讨论
  • 第五章 克氏原螯虾一种含有IG结构域的C-型凝集素可促进螯虾血细胞对细菌的吞噬作用
  • 一、前言
  • 二. 材料与方法
  • 1. 化学试剂及病原菌菌株
  • 2. 实验动物的刺激与样品收集
  • 3. cDNA序列的克隆
  • 4. 序列分析
  • 5. 实时荧光定量PCR
  • 6. PcLec3的全长和两个结构域的重组表达及纯化
  • 7. 蛋白免疫印记
  • 8. 细菌结合实验
  • 9. 重组PcLec3蛋白的多糖结合实验
  • 10. 免疫组织化学法检测鳗弧菌刺激后的螯虾血细胞
  • 11. PcLec3及其结构域的细胞粘附实验
  • 12. 体内病原吞噬实验
  • 三、结果
  • 1. 克隆得到PcLec3的cDNA全长
  • 2. PcLec3的序列分析结果
  • 3. PcLec3 mRNA的组织分布和表达模式
  • 4. PcLec3蛋白的重组表达和纯化
  • 5. PcLec3蛋白的组织分布
  • 7. 重组PcLec3的多糖结合实验
  • 8. 重组PcLec3的细胞粘附活性实验
  • 9. 重组PcLec3具有促进血细胞吞噬作用的能力
  • 四、讨论
  • 创新点总结
  • 参考文献
  • 致谢
  • 已发表文章
  • 学位论文评阅及答辩情况表
  • 附录

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