基于HCMV-gB抗原的疫苗分子设计及其免疫效果评价

论文摘要

人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）属于疱疹病毒科β亚科病毒,其感染对胎儿和免疫功能低下者危害严重。接种疫苗可能是某些高危人群预防和控制HCMV感染的有效措施。基于病毒表面糖蛋白gB的基因工程疫苗在孕期妇女与移植患者的二期临床试验中显示了良好的保护效果。为了进一步增强gB疫苗的免疫保护效果,本研究对新型gB候选疫苗抗原进行了分子设计和免疫效果评价。根据已经发表的HSV-1-gB的晶体结构,通过SWISS-Prot蛋白质晶体数据库在线模拟得到了gB的三维结构。模拟结果表明,已经发现的所有三个中和表位区AD-1、AD-2和DLD都位于gB分子的膜远端球状结构域。根据三维模拟结构和维持球状结构域构象的原则,本研究设计了gB1和gB2两个新型候选疫苗抗原。通过重组PCR扩增出编码gB1和gB2的融合基因片段,将其定向克隆到哺乳动物细胞表达载体pCI-neo中,用贴壁培养的293FT细胞进行蛋白的瞬时表达,并通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白。免疫印迹试验表明纯化的两个重组目的蛋白具有抗原性。以CpG-ODN + Al（OH）3作为gB1和gB2的免疫佐剂,通过两针肌肉注射免疫BALB/c小鼠,在五周内快速制备获得了两个重组蛋白的高效价免疫血清,经ELISA检测抗原特异IgG抗体滴度分别为1:6400～1:51200和1:25600～1:51200。用免疫血清对表达GFP的HCMV-VR1578病毒进行微量中和试验,结果表明:无补体存在时gB1和gB2免疫血清50%中和滴度分别为1:51.8和1:24.1,加入家兔补体后分别为1:744和1:264。综上所述,本研究成功地设计并验证了两个具有良好应用前景的新型HCMV-gB候选疫苗抗原,为进一步研究HCMV亚单位疫苗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 人巨细胞病毒疫苗的研究进展
• 1.1 HCMV 生物学特性
• 1.1.1 HCMV 的分类及结构特征
• 1.1.2 HCMV 入侵细胞的机制
• 1.2 HCMV 感染及危害
• 1.2.1 先天性HCMV 感染及其危害
• 1.2.2 器官移植患者及免疫力低下者HCMV 感染及危害
• 1.3 HCMV 疫苗研究的必要性及依据
• 1.4 HCMV 疫苗研究现状
• 1.4.1 减毒活疫苗
• 1.4.2 蛋白亚单位疫苗
• 1.4.3 病毒载体疫苗
• 1.4.4 DNA 疫苗
• 1.4.5 致密体候选疫苗
• 1.5 展望
• 试验研究
• 第二章 基于HCMV-gB 抗原的疫苗分子设计及其免疫效果评价
• 2.1 材料
• 2.1.1 仪器和设备
• 2.1.2 病毒标本、载体及细胞系
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 常用溶液配方
• 2.1.5 实验动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 目的基因的克隆
• 2.2.2 重组表达载体 pCI-neo- gB1、pCI-neo- gB2 和 pET21b（+）-gB90 的构建
• 2.2.3 gB90 蛋白表达纯化
• 2.2.4 重组质粒转染293FT 细胞及目的蛋白表达纯化
• 2.2.5 蛋白浓度测定（Bradford 法）
• 2.2.6 目的蛋白的Western blot 验证
• 2.2.7 免疫效果评价
• 2.2.8 数据分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 HCMV-gB 三维结构的模拟以及候选抗原gB1 和gB2 的分子设计
• 2.3.2 HCMV-gB、gB1 和gB2 融合基因的PCR 检测结果
• 2.3.3 哺乳动物细胞表达载体的构建及酶切鉴定
• 2.3.4 gB1 和gB2 在哺乳动物细胞中的表达和纯化结果
• 2.3.5 gB1 和gB2 的Western blot 验证结果
• 2.3.6 gB1 和 gB2 的免疫效果评价
• 2.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介