bFGF和CTLA4-Ig基因修饰的RPE细胞建立及其表达特性研究

论文摘要

目的应用慢病毒载体系统构建出稳定、高效表达碱性成纤维细胞生长因子和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白的视网膜色素上皮细胞,并检测其对视网膜色素上皮细胞表达特性的影响。方法1.稳定表达bFGF的视网膜色素上皮细胞的构建：将bFGF勺基因克隆到慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreenl中,转染293T细胞,包装出重组慢病毒,测定病毒滴度,感染视网膜色素上皮细胞,western blot方法检测各组中bFGF的表达。2.稳定表达CTLA4-Ig的视网膜色素上皮细胞的构建：分离人外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,经RT-PCR分别扩增CTLA4胞外段及IgG恒定区基因片段,将PCR产物克隆入质粒pCDNA3,获得CTLA4-Ig。将目的基因CTLA4-Ig克隆到慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreenl中,构建重组慢病毒载体。转染293细胞包装产生重组慢病毒,进一步感染视网膜色素上皮细胞,western blot测定CTLA4Ig表达情况。3.基因修饰后视网膜色素上皮细胞增殖情况的检测：MTT法检测：转染后RPE细胞克隆接种于96孔培养板中,培养24小时后加入MTT,再以DMSO溶解结晶物,酶联免疫检测仪测定光吸收值（OD值）,绘制生长曲线。以未转染视网膜色素上皮细胞为对照。结果1.酶切鉴定及基因测序表明成功了构建携带bFGF基因的慢病毒表达载体,包装后获得滴度为5×107IU/mL的重组慢病毒,western blot结果证实感染后1周、4周、12周的视网膜色素上皮细胞均可检测出bFGF的表达。2.成功获得目的基因CTLA4-Ig。酶切鉴定及基因测序表明成功了构建携带CTLA4-Ig基因的慢病毒表达载体,包装后获得滴度为4×107IU/mL的重组慢病毒,western blot结果证实感染后1周、4周、12周的视网膜色素上皮细胞均可检测出CTLA4-Ig的表达。3.各时间点转染bFGF细胞组、正常细胞组及转染CTLA4Ig细胞组OD平均值进行比较无明显差异（P>0.05）。对各组数据应用SPSS11.0进行拟合生长曲线模型,各组模型曲线变化趋势基本相同。结论应用慢病毒载体系统,可以成功建立稳定表达bFGF和CTLA4-Ig的视网膜色素上皮细胞,将有望解决视网膜色素上皮细胞移植治疗视网膜色素变性中的供体不足及移植过程中发生的免疫排斥反应及排斥反应带来的降低细胞因子表达等不良的影响。转染细胞产生较低水平的细胞因子未引起视网膜色素上皮细胞的异常增殖。

论文目录

• 前言
• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第1篇 文献综述
• 第1章 视网膜色素变性
• 1.1 患病率和遗传方式
• 1.2 视网膜色素变性综合征
• 1.3 症状
• 1.4 临床检查
• 1.5 致病基因
• 1.6 诊断和鉴别诊断
• 1.7 治疗
• 第2章 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白在眼科的应用
• 2.1 T细胞活化及CTLA4-Ig概述
• 2.2 CTLA4-Ig在眼科的应用
• 2.3 展望
• 第3章 慢病毒载体及其在视网膜色素变性研究中的应用概述
• 第2篇 研究内容
• 第1章 慢病毒介导的稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的视网膜色素上皮细胞的构建
• 1.1 材料与方法
• 1.2 实验结果
• 1.3 讨论
• 第2章 慢病毒介导的稳定表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白的视网膜色素上皮细胞的构建
• 2.1 材料和方法
• 2.2 实验结果
• 2.3 讨论
• 第3章 基因修饰后RPE细胞增殖情况的检测
• 3.1 材料与方法
• 3.2 实验结果
• 3.3 讨论
• 第3篇 结论
• 参考文献