克伦特罗免疫分析化学研究

论文摘要

本实验以克伦特罗（CL）为研究对象,合成了半抗原R—羧甲基醚（CL1）。采用活性酯法将CL1分别与载体蛋白BSA、OVA共价偶联,制备了人工抗原Ⅰ（CL1—BSA）和包被原Ⅰ（CL1—OVA）;采用重氮化法将CL直接与BSA、OVA共价偶联,制备人工抗原Ⅱ（CL—BSA）和包被原Ⅱ（CL—OVA）。经紫外扫描确定半抗原与载体蛋白偶联成功、结合比适当后,分别以CL1—BSA、CL—BSA为免疫原免疫新西兰白兔、制备抗血清。双向琼脂扩散法测定抗血清效价大于64:1后采集全血,离心分离血清。以硫酸铵分步盐析分离抗血清中的抗体并制成冻干粉。 以包被原Ⅰ进行固相包被,成功建立了CL间接竞争酶联免疫吸附分析法。方阵试验确定了包被原Ⅰ最佳包被浓度为1μg/mL,抗CL1—BSA抗体（抗体Ⅰ）的最佳工作浓度为1.25μg/mL。进一步研究了pH值、离子强度和有机溶剂对包被原Ⅰ和抗体Ⅰ的亲和作用的影响,结果表明:反应介质pH值在7.6时,包被原Ⅰ与抗体Ⅰ的亲和作用最强;在一定范围内离子强度增大会提高抗体与CL的亲和力;一定浓度的甲醇对包被原Ⅰ和抗体Ⅰ的亲和反应有促进作用,但是当甲醇含量超过40%时,抗体的非特异性吸附会大大增强,从而使得背景干扰加重。在优化条件下,建立了CL对包被原Ⅰ和抗体Ⅰ亲和反应的间接竞争ELISA标准抑制曲线,回归方程为I=18.90LogC+97.28,相关系数r=0.9915,抑制中浓度(IC50)为3.15ng/mL,IC20为0.08ng/mL,相对标准偏差RSD=8.03%（n=6）。 以包被原Ⅱ进行固相包被,经方阵试验确定包被原Ⅱ最佳浓度为6μg/mL,抗CL—BSA抗体（抗体Ⅱ）的最佳工作浓度为3μg/mL。建立CL对抗体Ⅱ与包被原Ⅱ的标准抑制曲线,回归方程为I=19.44LogC+72.07,r=0.9905,IC50=73.23ng/mL,IC20=2.10ng/mL,RSD=5.40%（n=6）。 在相同条件下,结构类似物沙丁胺醇（SAL）对抗体Ⅰ与包被原Ⅰ结合反应的抑制曲线方程为I=28.66LogC-22.58,IC50=340.76μg/mL,交叉反应率<0.0006%;而SAL对抗体Ⅱ与包被原Ⅱ结合反应的抑制曲线回归方程为I=16.87LogC+48.24,IC50=1.27μg/mL,交叉反应率为5.77%。通过对比可以发现,本实验以抗体Ⅰ和包被原Ⅰ为基础建立的间接竞争ELISA法在检测灵敏度和特异性方面均远远超过按照文献方法（重氮化法制备人工抗原、免疫动物制备的抗体Ⅱ）所建立的间接竞争ELISA法,可有效避免现有试剂盒假阳性率高的问题。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1.克伦特罗的应用状况
• 2.克伦特罗的检测方法
• 3.克伦特罗检测技术的未来趋势和发展方向
• 克伦特罗免疫分析化学研究
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 克伦特罗半抗原的合成与鉴定
• 1.2.2 克伦特罗人工抗原、包被原的合成与鉴定
• 1.2.3 抗体的制备
• 1.2.4 双向琼脂扩散法测定抗血清效价
• 1.2.5 抗体的分离
• 1.2.6 克伦特罗间接竞争ELISA法的建立
• 1.2.6.1 间接ELISA方阵试验确定包被原和抗体的最适工作浓度
• 1.2.6.2 间接ELISA法测定抗体与CL的反应性
• 1.2.6.3 其它影响因素的考察
• 1.2.7 抗体特异性的考察
• 2.结果与分析
• 1的HPLC、IR、NMR和MS分析图谱'>2.1 克伦特罗半抗原CL₁的HPLC、IR、NMR和MS分析图谱
• 2.2 人工抗原的鉴定结果
• 2.3 琼扩试验测定抗血清效价结果
• 2.4 抗体与包被原的最适工作浓度
• 2.5 CL间接ELISA法抑制标准曲线
• 2.6 其它影响因素的考察结果
• 2.7 抗体特异性的考察结果
• 3.讨论
• 3.1 人工抗原的设计
• 3.2 有机溶剂对包被原-抗体亲和反应的影响
• 3.3 间接竞争ELISA与直接竞争ELISA
• 3.4 与传统分析方法的比较
• 4.结论
• 参考文献
• 附录
• 发表文章
• 致谢