烟草花粉管内吞作用机制的细胞学和蛋白质组学研究

论文摘要

真核细胞中,内膜系统和分泌机制高度统一,密切配合。它们对细胞内外各种大分子物质的运输以及对质膜,液泡膜等的构成都起到关键性作用,这个过程相当复杂,包含内质网,高尔基体,各种分泌囊泡的系统作用以及一些起到媒介作用的细胞器,例如液泡前体等。其中,内吞作用是膜成分主要运输机制,它在花粉管和根尖这些生长旺盛的部位极其活跃,并和这些细胞的生长机制联系紧密。本文以烟草花粉为实验材料,使用Brefeldin A （BFA）和Ikaguramycin（IKA）这两种不同作用机理的抑制剂对生长中的花粉管进行处理,利用蛋白质组学技术获得差异表达的蛋白质图谱,并进行质谱分析。同时利用电子显微镜技术观察细胞亚细胞结构的形态变化,以探究烟草花粉管的内吞作用和生长机制。主要研究结果如下:1.获得了经抑制剂处理的差异表达的烟草花粉管蛋白图谱两种抑制剂具有不同的作用机制,它们或通过干扰细胞骨架结构或抑制内吞作用中的参与蛋白的合成装配,从而干扰植物细胞内吞作用。我们通过双向电泳技术,获得差异表达的蛋白质,并对差异显著点进行了MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,发现其中28个点的表达丰度在对照试验和经抑制剂处理过的花粉管间差异较为显著。鉴定出21种蛋白质,其中13个表达丰度上升,主要包括花粉管壁的修饰（果胶甲酯酶,高尔基体结合蛋白）、肌动蛋白细胞骨架组织（肌动蛋白）、能量代谢（ATP酶亚基1、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、焦磷酸酶、葡萄糖-1-磷酸酯尿甙基转移酶等）、信号转导（Rab GDP解离抑制因子、腺苷激酶）、蛋白质的折叠与加工（线粒体加工肽酶、蛋白质二硫化物异构酶）等;8个蛋白质的表达丰度下降,主要包括一些花粉致敏原和一些参与胁迫反应的蛋白质（过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽S-转移酶等）。2.利用电子显微镜技术研究了亚细胞结构的变化我们发现经过两种抑制剂处理的花粉管液泡明显减少,而在花粉管顶端出现大量小而多的分泌囊泡,在最顶端的区域能观察到较大的细胞器,例如线粒体和脂肪粒。通抑制剂处理后,有的高尔基体的堆叠发生一定弥散,还有一部分高尔基体趋向其反相发生弯曲,同时周围的分泌囊泡数量减少。我们还观察到内质网产生膨胀,一部分核糖体从从粗面内质网上脱离。但是并没有发现线粒体在对照以及处理中发生显著地差异。本文运用双向电泳结合串联质谱的方法检测了烟草花粉萌发及花粉管生长中蛋白质组的变化,鉴定了萌发前后差异表达的蛋白质,并分析了烟草花粉萌发过程中表达丰度变化蛋白质的功能类群特征,为进一步揭示烟草花粉内吞作用和花粉管生长的分子机理提供了重要的蛋白质信息。

论文目录

• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 网格蛋白
• 1.2 衔接蛋白
• 1.3 受体介导的内吞作用所涉及的其他几种生物大分子
• 1.4 植物细胞内吞作用的机制
• 1.4.1 网格蛋白的招募和包被的形成
• 1.4.2 包被小凹的形成以及内陷、缢缩
• 1.4.3 包被液泡的脱壳
• 1.5 花粉管的生长机制与内吞作用
• 1.5.1 花粉管的基本结构
• 1.5.2 花粉管生长过程中的信号传导网络
• 1.5.3 内吞、外排以及囊泡的转运
• 1.5.4 内质网、高尔基体与囊泡循环
• 1.6 植物细胞内吞作用的蛋白质组学研究
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 主要试剂
• 3.2 实验材料
• 3.3 花粉的萌发以及处理
• 3.4 透射电子显微镜分析
• 3.5 花粉管粗提和高速离心上清液（HSS）
• 3.6 蛋白质的提取
• 3.7 双向电泳
• 3.8 图像分析
• 3.9 MALDI-TOF 质谱分析
• 3.10 数据库查询和蛋白质信息分析
• 4 结果与分析
• 4.1 花粉萌发的观察
• 4.2 花粉管经处理后的形态以及超显微结构的变化
• 4.2.1 BFA 对花粉管形态和超显微结构的影响
• 4.2.2 IKA 对花粉管形态和超显微结构的影响
• 4.3 花粉管蛋白质表达的2-DE 图谱
• 4.4 质谱鉴定
• 4.5 萌发花粉差异蛋白质分析
• 4.5.1 差异表达蛋白的功能分类
• 4.5.2 参与信号转导的蛋白质
• 4.5.3 细胞骨架蛋白
• 4.5.4 参与能量代谢的蛋白质
• 4.5.5 参与细胞壁修饰的蛋白
• 5 结论与讨论
• 参考文献
• 英文摘要