棉花1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（GhACS1）基因的克隆及功能分析

论文摘要

乙烯作为一种重要的内源信号分子,在植物的生长发育过程中起了重要作用,它不仅能强烈影响种子的萌发、根毛的生长、花的衰老、脱落以及果实的成熟（Johnson and Ecker, 1998）,而且还能响应于各种的生物或非生物胁迫,如病原菌入侵、伤害、冷害、臭氧、Li+等。高等植物乙烯的生物合成过程中由S-腺苷蛋氨酸合成ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）的反应被认为是关键步骤,催化此反应的ACC合成酶（1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶）就成为乙烯合成过程中的关键酶。近年来许多的ACC合成酶基因（ACS）不断从不同植物中克隆出来,其表达模式也得到了广泛的研究,而且利用转基因的方法获得的反义植株表现出明显的抑制乙烯合成的特性。棉花是一种重要的经济作物,近年来利用基因工程方法培育棉花新品种已经成为棉花育种的研究热点。本文以鲁棉22为材料,首次从棉花中克隆了ACS基因（GhACS1）,并对其进行了序列比对,表达特性分析及功能鉴定。具体结果如下:1、本研究从棉花中首次分离得到一个伤害诱导的ACS基因,即GhACS1,GenBank注册号为DQ355792。其全长1802bp,有一个1428bp的开放阅读框（ORF）,编码一个476氨基酸的多肽。序列分析发现GhACS1具有植物ACS基因的典型特征,有7个高度保守区、11个不变残基和活性中心。该基因与来自柑橘、烟草、马铃薯、大豆、绿豆、拟南芥的ACS基因有较高的同源性。GhACS1与一些伤害诱导的基因如CsACS1、CsACS2、NtACS2、GmACS1和LeACS2在进化上显示出更进的亲缘关系。2、Southern杂交结果表明在棉花基因组中可能存在多个与GhACS1具有一定同源性的其他ACS基因,或者说棉花中的ACS是由一个多基因家族所编码的。比较GhACS1 cDNA序列与其基因组序列,发现GhACS1基因组序列内存在两个内含子,且这两个内含子都靠近该基因的5′端,这与植物ACS基因组中内含子位置保守的特性一致。3、半定量RT-PCR分析发现GhACS1是一个诱导表达的基因,可被伤害、ABA和Cu2+诱导而短暂表达,真菌、冷害、IAA、LiCl、NaCl不能诱导该基因的表达,表明该基因不是一个多反应基因,它只能被一些的外界胁迫所诱导,可能参与了某些胁迫信号转导过程中乙烯的合成。4、构建原核表达载体pET-GhACS1,并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,检测到微弱的表达条带,推测可能与该基因在植物组织内短暂表达的特性有关。5、将GhACS1构建了正义植物表达载体pBI122-GhACS1,采用农杆菌介导的冻融法,转化烟草（NC89）,并以转空载体的植株作为对照。卡那霉素筛选转基因植株。6、LA PCR的方法获得部分启动子序列,序列分析发现一些启动子特有的核心元件,以及一些功能响应元件。

论文目录

• 英文缩写符号及其中英文对照表
• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 乙烯在植物生长发育过程中的重要作用
• 1.1.1 乙烯与植物的生长
• 1.1.2 乙烯与生物或非生物胁迫
• 1.1.3 乙烯与植物的抗病性
• 1.1.3.1 依赖乙烯的 SAR
• 1.1.3.2 依赖乙烯的 ISR
• 1.2 乙烯合成途径中关键酶研究进展
• 1.2.1 乙烯的生物合成途径
• 1.2.2 ACC 合成酶是多基因家族
• 1.2.3 ACC 合成酶的分子克隆
• 1.2.4 ACC 合成酶的结构特点
• 1.2.5 ACC 合成酶的表达调控
• 1.2.5.1 植物 ACS 基因表达的诱导因子
• 1.2.5.2 环境胁迫的诱导
• 1.2.5.3 不同发育阶段的诱导
• 1.2.5.4 同种植物不同 ACS 基因器官表达的特异性差异
• 1.2.5.5 植物不同 ACS 基因时空表达的特异性差异
• 1.2.5.6 植物不同 ACS 基因转录水平上的表达差异
• 1.2.6 ACC 合成酶启动子研究进展
• 1.3 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料培养与处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶与各种生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA 提取
• 2.2.1.1 利用RNeasy Plant Mini Kit 提取总 RNA
• 2.2.1.2 利用TRIZOL 试剂盒提取 RNA
• 2.2.2 cDNA 第一链的合成
• 2.2.3 cDNA 回收纯化
• 2.2.4 cDNA 的5′加尾反应
• 2.2.5 cDNA 全长序列的获得
• 2.2.5.1 简并引物 PCR 获得 GhACS1 中间片段
• 2.2.5.2 5′RACE获得5′端序列
• 2.2.5.3 3′RACE获得3′端序列
• 2.2.5.4 cDNA全长序列的获得
• 2.2.5.5 GhACS1 全长基因组序列的获得
• 2.2.6 目的片段的回收
• 2.2.7 目的片段与克隆载体的连接
• 2.2.8 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.10 质粒 DNA 的提取
• 2.2.10.1 碱法小量提取质粒 DNA
• 2.2.10.2 大量提取质粒 DNA
• 2.2.10.3 试剂盒质粒微量提取方案
• 2.2.11 对重组质粒的鉴定
• 2.2.11.1 对重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.11.2 对重组质粒的菌液 PCR 鉴定
• 2.2.12 半定量 RT-PCR 检测目的基因的表达
• 2.2.13 Northern 杂交
• 2.2.13.1 RNA 提取
• 2.2.13.2 琼脂糖甲醛变性胶电泳
• 2.2.13.3 转膜及烘膜
• 2.2.13.4 探针合成
• 2.2.13.5 预杂交及杂交
• 2.2.14 Southern 杂交
• 2.2.14.1 基因组DNA 的提取
• 2.2.14.2 限制性内切酶消化
• 2.2.14.3 转膜
• 2.2.14.4 探针合成
• 2.2.14.5 预杂交及杂交
• 2.2.15 启动子的克隆
• 2.2.15.1 DNA 的限制酶酶切反应
• 2.2.15.2 连接反应
• 2.2.15.3 PCR 扩增
• 2.2.16 植物表达载体的构建与转化
• 2.2.16.1 植物正义表达载体的构建
• 2.2.16.2 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.16.3 冻融法转化农杆菌
• 2.2.16.4 农杆菌介导转化烟草
• 2.2.17 原核表达
• 2.2.17.1 试剂配制
• 2.2.17.2 原核表达载体的构建
• 2.2.17.3 大肠杆菌BL21 原核表达的诱导
• 2.2.17.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3 结果与分析
• 3.1 棉花ACC 合成酶基因的分离
• 3.1.1 棉花RNA 的提取及反转录
• 3.1.2 棉花GhACS1 中间片段的克隆与测序
• 3.1.3 GhACS1 5′片段的分离
• 3.1.4 GhACS1 3′片段的分离
• 3.1.5 GhACS1 全长cDNA 的分离
• 3.2 GhACS1 的序列分析
• 3.2.1 GhACS1 的全长cDNA 分析
• 3.2.2 GhACS1 编码蛋白序列分析
• 3.2.3 GhACS1 基因组序列分析
• 3.3 GhACS1 在棉花基因组中的拷贝数分析
• 3.4 GhACS1 基因在外界胁迫条件下的表达特性分析
• 3.4.1 GhACS1 基因在第一组外界胁迫下的表达特性分析
• 3.4.2 GhACS1 基因在第二组外界胁迫下的表达特性分析
• 3.5 GhACS1 基因的原核诱导表达
• 3.6 GhACS1 基因的真核表达
• 3.6.1 转基因烟草表达载体的构建
• 3.6.2 根癌农杆菌的转化
• 3.6.3 再生植株的获得
• 3.7 GhACS1 基因部分5′侧翼区的获得及响应元件的鉴定
• 4 讨论
• 4.1 GhACS1 基因序列特征分析
• 4.2 GhACS1 在外界胁迫条件下的诱导表达分析
• 4.3 GhACS1 的原核表达
• 4.4 GhACS1 基因启动子的克隆
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 附: 硕士阶段已发表论文