论文摘要
目的梅毒是由梅毒螺旋体（Treponema pallidum subsp.pallidum,TP）引起的一种危害性极大的全世界流行的性传播疾病（STD）。采用基因工程抗原建立的酶联免疫吸附实验（ELISA）实验以其快速、简便、经济等优点在临床梅毒检测中得到广泛的应用,但是,目前的检测方法仍然存在灵敏性差、假阳性率高、早期梅毒感染的检出能力较差等缺点,急需寻找新的特异性和灵敏度更高的抗原来提高梅毒早期检出率。本研究旨在通过生物信息学及基因工程技术筛选、制备梅毒螺旋体多种重组外膜蛋白抗原,探讨其在梅毒血清诊断中的价值,为进一步研究开发临床检测效果更好的新型梅毒酶联免疫诊断试剂盒提供理论依据和实验数据。方法1.通过文献调研,筛选出具有良好诊断潜力的梅毒螺旋体特异性外膜抗原。再用生物信息学方法预测上述抗原蛋白的二级结构及抗原决定簇分布情况,分别选定各个抗原中抗原决定簇丰富、抗原性高、特异性高的区域。2.根据筛选的基因（TP17、TP0453、TP0684）,用分子克隆的方法构建重组表达质粒pET22b（+）-TP17、pET-28a（+）-TP0453、pET22b（+）-TP0684,转化工程菌大肠杆菌进行表达,用亲和层析、离子交换、凝胶过滤层析等多种方法联合纯化,获得纯度较高的目的蛋白。3.将纯化后的TPN17、TP0453、TP0684蛋白进行SDS-PAGE后电转移至NC膜,分别以梅毒标准阳性、阴性血清作为一抗,HRP标记的羊抗人IgG为二抗,进行重组蛋白的免疫印迹分析。4.以上述纯化蛋白为抗原,单独或联合包被酶联免疫反应板,建立间接ELISA方法检测梅毒标准阳性和阴性血清。摸索最适抗原包被组合和包被浓度、最适抗原吸附方式、最适封闭液和封闭时间、最适血清反应时间和反应温度、最适二抗工作浓度、最适显色液等条件。5.用已优化的ELISA检测体系对各期梅毒病人、正常人、易发生交叉反应人群、国家质控参比血清进行检测,进行方法学评价。结果1.通过生物信息学分析和文献调研,选择TP17、TP0453、TP0684三个梅毒特异性外膜蛋白作为候选诊断抗原,并预测出各个蛋白抗原决定簇较丰富、抗原性较强、特异性高的区域,分别是:TPN17（22156aa）、TP0453（29287aa）、TP0684（30434aa）。2.成功构建了能够高效表达TP17、TP0453、TP0683优势表位区域的重组表达质粒:pET22b（+）-TP17、pET28a（+）-TP0453、pET22b（+）-TP0684。序列分析与Genbank公布的相应序列完全一致。3.重组质粒转化E.coli BL21（DE3）,获得重组工程菌后,经IPTG诱导,表达的目的蛋白TP17、TP0453、TP0684分子量约为18kDa、29kDa、43kDa。UVP扫描证实目的蛋白的表达分别约占总蛋白的18%、24%和32%。对表达形式进行鉴定:TP17为可溶形式表达;TP0453、TP0684为包涵体形式表达。4.用亲和层析、离子交换、凝胶过滤层析等方法联合对TPN17蛋白进行纯化,获得的蛋白纯度>95%;用亲和层析方法对TP0453蛋白进行纯化,获得的蛋白纯度>90%;用亲和层析方法对TP0684蛋白进行纯化,获得的蛋白纯度>85%。5.免疫印迹结果显示重组蛋白TP17、TP0453、TP0684与梅毒标准阳性血清有良好的免疫反应性,而与梅毒阴性血清不发生反应。6.采用不同抗原组合,建立并优化ELISA方法,检测梅毒病人血清,发现检测的灵敏度和特异性受抗原种类和组合比例的影响,抗原联合使用比单个抗原效果好,其中最适的抗原组合为TP17和TP0453抗原,而TP0684抗原在ELISA检测中效果不好;最适包被浓度为TP17（0.5μg/ml） +TP0453（1μg/ml）;抗原最适吸附方式为37℃孵育4h转4℃过夜;最适封闭条件为1% BSA 37℃封闭2h转4℃过夜;最适血清反应条件为37℃温育45min;酶标二抗1:15000稀释;以TMB为最适显色液底物。7.经各种标本检测和方法学评价,以TP17和TP0453组合抗原为诊断抗原建立的间接ELISA方法对标准血清盘的检测灵敏度为94.4%,特异性为97.1%,符合率95.7%,最低检出限为0.25NCU/ml;与非梅毒血清没有交叉反应性;与TPPA方法一致性好,特异性高于市场上已有国产ELISA检测试剂盒。结论1.预测出了梅毒螺旋体TP17、TP0453、TP0684三个特异性抗原基因中抗原表位丰富的区段。2.高效表达了TP17、TP0453、TP0684三种蛋白,并采用亲和层析、离子交换、凝胶过滤层析等多种方法分别对其进行了纯化。3.建立并优化了应用TP17、TP0453蛋白作为诊断抗原检测血清中梅毒特异性抗体的ELISA方法。本方法在初步应用中显示了较高的特异性和灵敏度,与金标准TPPA方法有优良的一致性,为研发新型梅毒诊断试剂盒奠定了理论和实践基础。4. TP0684在免疫印迹实验中显示了良好的免疫反应性,提示有望作为新的检测抗原,但在ELISA方法中的诊断价值还有待进一步摸索。