植物乳杆菌ZS2058生物转化共轭亚油酸反应体系的研究

论文摘要

共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid, CLA）是亚油酸（Linoleic Acid, LA）衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有很多营养和保健功能,如抗癌、抗动脉粥样硬化和延缓机体免疫力衰退、减肥等。在共轭亚油酸的各种立体异构体中,c9, t11-CLA被认为最具生物活性。由于乳酸菌生物转化共轭亚油酸具有安全性高、专一性强等优点,目前已经成为合成共轭亚油酸的研究热点。本文通过结合气相色谱法（GC）、银离子高效液相色谱法（Ag+-HPLC）和气质联用法（GC-MS）三种检测方法,确定了植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA的产物主要有c9, t11-CLA、t10, c12-CLA及t, t-CLA,并选择气相色谱法作为本课题的定量检测方法。通过比较植物乳杆菌ZS2058完整细胞在有机介质、微水介质、两相介质和水介质中生物转化CLA的产量,确定最适合植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA的反应介质为水介质。在1mL磷酸钾缓冲溶液反应体系中,通过单因数实验和响应面分析,确定了最合适的反应条件为:底物浓度为0.8 mg/mL,细胞浓度为4×1010 cfu/mL,反应温度为37℃,缓冲液pH值为6.5。在此反应条件下,c9, t11-CLA的浓度为374μg/mL,转化率高达46.75%。在此基础上,本论文探讨了底物浓度、细胞浓度、反应体系pH值、反应温度等因素对植物乳杆菌ZS2058完整细胞生物转化CLA的反应速度的影响。实验结果表明存在明显的底物抑制现象,当LA浓度达到0.4 mg/mL时,产生c9, t11-CLA的反应速度达到最大值,为15.99μg/（mL?h）;反应速度随着细胞浓度增加而上升,当细胞浓度达到5×1010 cfu/mL时,反应速度达到最高;生物转化CLA的最适pH值和最适温度分别为6.5和40℃。同时利用双倒数作图法和Hanes-Woolf作图法求得米氏常数,并建立了反应初始阶段不同底物浓度范围内的速度方程。在低底物浓度下,反应规律与酶学上经典的米氏方程相符合,米氏常数为:Vmax:21.74μg/（mL·h）;Km:0.16 mg/mL。在高底物浓度下,存在明显的底物抑制现象,但反应速度方程与经典的底物抑制速度方程存在差异。最后对所建立的速度方程进行了验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 共轭亚油酸（CLA）及其生理功能
• 1.1.1 共轭亚油酸
• 1.1.2 共轭亚油酸的生理功能
• 1.2 共轭亚油酸的分析检测
• 1.2.1 紫外检测法
• 1.2.2 气相色谱法
• 1.2.3 高效液相色谱法
• 1.3 共轭亚油酸的合成
• 1.3.1 化学法合成CLA
• 1.3.2 生物法合成CLA
• 1.4 亚油酸异构酶的研究进展
• 1.5 立题意义及主要研究内容
• 1.5.1 立题意义
• 1.5.2 主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 药品试剂
• 2.2 仪器设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 亚油酸及其乳浊液的制备
• 2.3.2 细胞的收集
• 2.3.3 生物转化的条件
• 2.3.4 脂肪酸提取
• 2.3.5 脂肪酸甲酯化
• 2.3.6 生物转化共轭亚油酸反应产物的确定
• 2.3.7 生物转化共轭亚油酸反应介质的选择
• 2.3.8 生物转化共轭亚油酸反应条件的研究
• 2.3.9 生物转化共轭亚油酸反应速度的研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 生物转化共轭亚油酸反应产物的确定
• 3.1.1 气相色谱法分析
• 3.1.2 银离子高效液相色谱法分析
• 3.1.3 气质联用法分析
• 3.1.4 生物转化共轭亚油酸定量方法的确定
• 3.2 生物转化共轭亚油酸反应介质的选择
• 3.2.1 冷冻干燥对生物转化CLA 的影响
• 3.2.2 有机介质对生物转化CLA 的影响
• 3.2.3 微水介质对生物转化CLA 的影响
• 3.2.4 两相介质对生物转化CLA 的影响
• 3.3 生物转化共轭亚油酸反应条件的研究
• 3.3.1 诱导培养对生物转化CLA 的影响
• 3.3.2 反应时间对生物转化CLA 的影响
• 3.3.3 氧环境对生物转化CLA 的影响
• 3.3.4 细胞浓度对生物转化CLA 的影响
• 3.3.5 底物浓度对生物转化CLA 的影响
• 3.3.6 反应缓冲液pH 值对生物转化CLA 的影响
• 3.3.7 反应温度对生物转化CLA 的影响
• 3.3.8 响应面分析优化生物转化CLA 的条件
• 3.4 生物转化共轭亚油酸反应速度的研究
• 3.4.1 底物浓度对生物转化速度的影响
• 3.4.2 细胞浓度对生物转化速度的影响
• 3.4.3 反应缓冲液pH 值对生物转化速度的影响
• 3.4.4 反应温度对生物转化速度的影响
• 3.4.5 速度方程的拟合
• 3.4.6 速度方程的验证
• 主要结论
• 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：攻读硕士学位论文期间发表的论文