Truncated ApoE4在AD发病中的作用及机制研究

论文摘要

老年性痴呆（Alzheimer desease，AD）是一种原发型、成年型、皮层痴呆，其主要病理改变为神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）和老年斑（senile plaques，SP）的形成。NFTs的主要成份是过度磷酸化的微管相关tau蛋白和神经细丝。SP的主要成份是聚集的β淀粉样蛋白（amyloid peptide beta，Aβ）。在NFTs和SP中，均发现了载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）的存在。统计资料表明，携带有ApoE-ε4等位基因的个体其NFTs的数目显著增加，且NFTs的数目与AD病人的痴呆程度成正相关。目前人们普遍认为apoε4是AD的易患因素，具有apoε4的个体其患AD病的危险性升高，并可使AD发病年龄提前。但其机制仍未十分明了。最新研究发现，AD患者脑组织中存在截断的apoE4片段（为C末端的272—299位氨基酸残基被蛋白酶水解截去的apoE4片段，以下记为truncated-apoE4）；并且在AD脑的NFTs中也存在大量的truncated-apoE4片段，而非全长apoE4。进一步研究发现：在全长apoE4转基因鼠中仅老龄鼠出现老年斑，幼龄鼠未见病理改变。而truncated-apoE4转基因鼠在幼龄即形成老年斑。这些研究强烈提示truncated-apoE4可能是在AD病变中发挥作用的apoE4分子。因此，探讨truncated-apoE4与AD脑的两大病理改变之间的联系是有关研究领域的热点课题。truncated-apoE4只在C末端缺失了28个氨基酸，此片段并不属于apoE4已知的功能域。那么此片段的缺失对apoE4的功能产生了什么影响呢?本研究从分子水平、细胞水平和动物水平，研究apoE4经“片段缺失”导致的生物学功能改变。本研究为AD两大脑病理特征之间的联系提供了新资料，获得了一些创新性的研究结果，简述如下：第一部分Truncated-ApoE4过表达对N2a细胞中tau和神经细丝磷酸化的影响apoE4是公认的AD易患因子，但apoE4基因及其蛋白产物增加AD易患性及加快AD进程的机制尚不清楚。神经纤维缠结（NFTs）的形成是AD的特征性病理改变之一，主要由过度磷酸化的tau蛋白和神经细丝（NF）组成。研究显示在AD患者脑组织和体外培养的神经元细胞中，apoE4蛋白C末端的272—299位氨基酸残基可被糜蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶水解截去，产生truncated-apoE4片段；另外在AD脑的NFTs中存在大量的truncated-apoE4而非全长apoE4，且与NFTs中的磷酸化tau和NF相互作用。由此我们推测这种truncated-apoE4的产生可能与tau和／或NF的磷酸化有关从而参与了AD的发病过程。基于此我们构建了truncated-apoE4真核表达重组体pEGFP-T-apoE4，并在N2a细胞内成功实现了全长及truncated-apoE4的过度表达。免疫细胞化学结果显示：pEGFP-apoE4及pEGFP-T-apoE4转染组细胞内磷酸化tau及NF较对照组显著增加（p＜0.01），且pEGFP-T-apoE4转染组最显著（p＜0.05）。提示truncated-apoE4过度表达较全长apoE4过度表达具有更强的磷酸化tau和NF的能力。由于GSK-3和CDK-5是AD脑中磷酸化tau和NF的关键激酶，我们进一步检测了GSK-3和CDK5的酶活性，结果显示：pEGFP-apoE4及pEGFP-T-apoE4转染组N2a细胞中GSK-3酶活性与对照组相比显著增高（p＜0.01），且pEGFP-T-apoE4转染组更显著（p＜0.05）；而转染组N2a细胞中CDK5酶活性与对照组相比无显著性差异（p＞0.05）。结果表明全长apoE4及truncated-apoE4均可导致tau和NF磷酸化程度增强，这可能与GSK-3的激活有关。随后，我们在实验中分别制备了全长及truncated-apoE4条件培养基，并以此条件培养基培养N2a细胞24h后，检测细胞内tau和NF磷酸化程度，以及CDK5和GSK-3的酶活性，同时检测细胞内apoE受体信号途径中Dabl蛋白的磷酸化程度。结果表明：细胞外全长及truncated-apoE4均未引起N2a细胞内tau和NF磷酸化程度明显增加，且GSK-3和CDK5的酶活性亦无显著改变，细胞内Dabl的磷酸化程度较对照组显著增高，但两组之间无显著性差异。文献报道，dab1磷酸化后可抑制GSK-3和CDK5的酶活性，以上结果提示可能是细胞内而非细胞外全长apoE4和／或truncated-apoE4通过某种机制激活GSK-3，从而导致tau和NF磷酸化程度增加，其机制尚待进一步研究。综上所述，我们的研究结果表明全长apoE4和truncated-ApoE4过度表达均可通过激活GSK3导致N2a细胞中tau和NF的过度磷酸化，但truncated-ApoE4转染组更显著。我们推测truncated-apoE4的产生可能是apoE4增加AD易患性及加快AD进程的机制之一。第二部分truncated-apoE4重组体的在体转染阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一种神经退行性疾病，主要病理改变为神经原纤维缠结和老年斑的形成，其主要临床症状为记忆障碍和认知功能下降。研究显示tau的磷酸化程度与记忆力呈正相关，我们前述的细胞水平研究显示：全长及truncated-apoE4过表达均可导致tau和NF的磷酸化程度增强，本研究将进一步在整体动物水平研究全长及truncated-apoE4在AD发病中的作用及可能机制。我们在大鼠海马局部瞬时转染pEGFP-apoE4和pEGFP-T-apoE4，Morris水迷宫动物行为学测试结果显示：pEGFP-apoE4和pEGFP-T-apoE4转染均可导致大鼠的空间记忆能力显著下降，且pEGFP-T-apoE4转染组更显著。免疫组织化学结果表明：pEGFP-apoE4和pEGFP-T-apoE4转染后均可引起海马区tau的磷酸化程度增强，且pEGFP-T-apoE4转染组更显著。我们进一步检测海马组织匀浆中相关蛋白激酶活性，结果显示：pEGFP-apoE4和pEGFP-T-apoE4转染组GSK-3酶活性较对照组显著增高（p＜0.01），且pEGFP-T-apoE4转染组更显著（p＜0.05），而各组间CDK5酶活性无显著性差异（p＞0.05）。此结果进一步在整体动物水平验证了前述细胞水平的实验现象。我们在术后24—48h取双侧海马组织匀浆，检测海马组织匀浆中Aβ的聚集程度，结果显示：pEGFP-apoE4和pEGFP-T-apoE4转染组均可导致大鼠海马组织Aβ聚集（p＜0.05），且pEGFP-T-apoE4转染组具有更强的促进Aβ聚集的作用。因此，我们的研究结果表明全长apoE4和truncated-apo4过表达可诱导大鼠AD样神经退行性变和行为学损伤，且truncated-apo4转染组更显著。第三部分truncated-apoE4对Aβ代谢的影响脑组织中老年斑（SP）的形成是AD的主要病理改变之一，Aβ是SP的主要组成成分。研究显示apoE与AD脑中SP共存，且Aβ的沉积程度与apoE4频率呈正相关，另外，研究显示在体外apoE可与Aβ结合形成复合物，这些结果强烈提示apoE可能影响大脑Aβ产生的速率。因此，apoE成为研究脑组织中清除Aβ的最佳候选者，但其等位基因变异体apoE4是促进还是抑制Aβ的聚集和聚合仍然存在争论。我们的前述研究发现：全长apoE4和truncated-apoE4均可导致大鼠海马组织内Aβ聚集，且truncated-apoE4转染组具有更强的促进Aβ聚集的作用。Aβ是由淀粉样前体蛋白（APP）水解产生的分子量约4kD的多肽，其中以Aβ40最丰富，其次是Aβ42。虽然Aβ42仅占5％，但具有更强的疏水性、聚集性和神经毒性。因此，我们进一步在体外实验中比较全长apoE4、truncated-apoE4与Aβ42的结合能力和结合后SDS耐受性的差异，以及两种apoE4对神经元结合和摄取Aβ42的影响。我们在体外分别将两种apoE4条件培养基与Aβ42共孵育，制备并获得两种apoE4-Aβ42复合物，采用不含SDS的聚丙烯酰胺凝胶为支持物进行电泳，结果显示：Aβ42可与两种apoE4结合形成分子量约40kD的可溶性复合物。换用SDS-PAGE后，结果显示：Aβ42可从两种复合物中释放出来，且truncated-apoE4-Aβ42复合物中Aβ的释放程度显著高于全长apoE4-Aβ42复合物（p＜0.05）。由于非结合型Aβ虽然具水溶性但更易聚集，因此我们的结果提示：truncated-apoE4在体内可能具有更强的促进Aβ聚集的作用。另有研究表明Aβ与apoE3结合后对蛋白酶K具高度敏感性，提示apoE3可促进Aβ被蛋白酶解并易被细胞膜受体识别清除，从而有效促进Aβ的降解。因此，为探讨apoE4促进Aβ聚集的分子机制，我们进一步在体外比较了全长apoE4和truncated-apoE4对Aβ42代谢的影响，结果显示：truncated-apoE4-Aβ42共孵育组N2a细胞结合及摄取Aβ42的能力显著低于全长apoE4-Aβ42共孵育组。以上结果表明：与全长apoE4相比，truncated-apoE4-Aβ42复合物的SDS稳定性降低，truncated-apoE4可显著降低N2a细胞结合及摄取Aβ42的能力，提示truncated-apoE4具有更强的促进Aβ聚集的作用。因此，我们推测truncated-apoE4的产生可能是apoE4基因携带者易患AD的分子机制之一，抑制truncated-apoE4的产生可能是探索预防AD发生和减缓AD发展的一个新途径。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分:Truncated-ApoE4过表达对N2a细胞中tau和神经细丝磷酸化的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分:truncated-apoE4重组体的在体转染
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分:truncated-apoE4对Aβ代谢的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述
• 参考文献
• 附录 攻读博士期间发表论文目录
• 致谢