论文摘要
目的本实验通过比较临床采集的吸烟和非吸烟慢性牙周炎患者龈沟液（Gingival crevicular fluid,GCF）与健康吸烟和非吸烟者龈沟液的基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase-9,MMP-9）水平,探讨吸烟对慢性牙周炎龈沟液中MMP-9的影响,从而推断和证实吸烟对慢性牙周炎的作用,为牙周病的防治提供理论依据。本实验还通过不同浓度的尼古丁刺激体外培养的人牙龈成纤维细胞（Human gingival fibroblasts,HGFs）,观察其在生长、增殖活性方面的影响,不同浓度的尼古丁和一定浓度尼古丁不同时间段下对体外培养的HGFs分泌MMP-9的影响,通过对细胞的MMP-9蛋白表达水平的研究,初步探讨尼古丁对牙龈成纤维细胞分泌MMP-9的影响。方法1研究吸烟和非吸烟健康者龈沟液,吸烟和非吸烟慢性牙周炎龈沟液MMP-9水平。在临床上采集龈沟液,采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）测定其中的MMP-9水平。2（1）于临床取得正常牙龈组织,采用传统组织块法进行人牙龈成纤维细胞的原代培养,运用第四代细胞进行细胞形态的观察和细胞免疫组织化学染色（2）取生长良好的第四代细胞制成1×104/ml的单细胞悬液,每孔100μl均匀接种于96孔板,用不同浓度的尼古丁（10μg/ml,50μg/ml, 100μg/ml,250μg/ml,500μg/ml, 1000μg/ml,2000μg/ml）刺激牙龈成纤维细胞,运用四甲基偶氮唑盐比色法（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）检测牙龈成纤维细胞在不同浓度尼古丁刺激下的相对增殖率和生长抑制率,从而观察尼古丁对牙龈成纤维细胞在生长及增殖活性方面的影响。（3）24孔板内以每孔1×104的细胞密度将第四代牙龈成纤维细胞接种于盖玻片上,24h细胞贴壁后弃原培养液用2%DMEM培养液静息24h,实验组换含不同浓度尼古丁的2%DMEM培养,对照组则不加尼古丁刺激只用2%DMEM培养,然后分别在不同的时间段：Oh、4h、8h、24h及24小时后,不同浓度：1000μg/ml,100μg/ml, Oμg/ml,制备牙龈成纤维细胞的细胞爬片,冰丙酮固定,运用细胞免疫组织化学染色方法SP法检测MMP-9在HGFs中表达的量,从而观察尼古丁对牙龈成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶的影响。结果1慢性牙周炎患者中,吸烟组的MMP-9水平高于非吸烟组（P<0.05）。慢性牙周炎吸烟和非吸烟组的MMP-9水平明显高于健康组（P<0.05）。健康吸烟组MMP-9水平和非吸烟组无显著性差别。2不同浓度尼古丁刺激牙龈成纤维细胞MTT结果显示：与阴性对照组相比,第一天10μg/ml组（A）、10μg/ml组（B）、100μg/ml组（C）、250μg/ml组（D）、500μg/ml组（E）、1000μg/ml组（F）、2000μg/ml（G）HGF的相对抑制率分别为4.36%,6.03%,8.86%,11.51%,16.33%,21.67%,25.26%;第二天结果显示：9.45%,14.66%,18.11%,22.76%,25.65%,34.12%,39.52%;第三天结果显示：11.97%,15.83%,20.31%,25.12%,28.89%,44.58%,50.66%。三天结果显示七组抑制率均逐渐增高且呈浓度依赖关系,即尼古丁浓度越大,HGF抑制率越高。3细胞免疫组织化学方法检测牙龈成纤维细胞在尼古丁刺激下不同时间段MMP-9表达量的结果显示：MMP-9抗体主要在牙龈成纤维细胞的胞浆表达,在Oh,4h,8h,24h, MMP-9表达的量分别为0.0481±0.0093,0.0774±0.009, 0.0980±0.0092,0.1296±0.0225,（与Oh相比,P<0.01）24小时后,MMP-9在对照组,100μg/ml,及1000μg/ml的表达分别为0.0570±0.0096,0.1296±0.0225,0.2161±0.0301（与对照组相比,P<0.01）表达趋势逐渐增强。结论1吸烟对慢性牙周炎GCF中MMP-9水平变化有影响。2尼古丁可影响牙龈成纤维细胞的增殖活性：尼古丁对其有毒性作用,抑制其增殖,且随着时间延长抑制率越来越高。3牙龈成纤维细胞在正常情况下可表达少量的MMP-9,受尼古丁刺激后表达基质金属蛋白酶-9的量显著增多。
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