OPG对破骨细胞活性的影响及其信号转导机制

论文摘要

骨保护素（osteoprotegerin, OPG）是肿瘤坏死因子受体超家族成员,它最主要的生物学作用是抑制体内破骨细胞（osteoclast, OC）的分化、活化,并促进其发生凋亡。临床试验及动物实验表明,重组OPG蛋白和OPG基因治疗等技术手段,对防治人及动物的骨营养不良性疾病具有一定的应用价值。但是关于OPG对OC的调控机制仍不完全清楚,对于OPG相关药物的开发及其普遍运用仍存在诸多困难。本文以原代分离鸭胚OC及诱导获取OC模型为研究对象,在体外培养过程中添加不同浓度OPG,通过形态学鉴定、细胞活性检测、实时荧光定量PCR （QRT-PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）等技术手段,研究OPG对OC分化、活性及凋亡中形态、功能、相关基因及关键信号蛋白的影响。本研究以期为OPG调控OC活性的机理提供理论依据。研究内容如下：1.OPG对破骨细胞分化、活化及凋亡的影响为了研究OPG对体外培养鸭胚OC分化、活化与凋亡的影响,收集23日龄鸭胚骨髓细胞,体外培养过程中分组加入不同浓度OPG进行处理（A组：无因子；B组：30ng/mL OPG; C组：100ng/mLOPG）。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色（tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP）,骨吸收陷窝分析,OC骨架（TRITC标记的鬼笔环肽,TRITC-conjugated phalloidin）及胞核（Hoechst33258）染色技术,检钡TRAP阳性细胞、OC的骨吸收活性以及OC凋亡状态。结果显示,三个实验组中TRAP阳性细胞数、OC的骨吸收活性均在OPG处理7d后达到最高水平。与对照组相比,OPG处理组OC数目及OC的骨吸收活性显著减弱（P<0.05）,每个时间段骨吸收陷窝净增长面积与OC数目变化趋势一致。OPG能够抑制OC内纤维状肌动蛋白环（Filamentous-actin rings, F-actin rings）的形成,并且能够促进成熟OC内F-actin环的崩解。此外,OPG能够诱导成熟OC发生凋亡,OC的形态及核发生改变。表明OPG能够抑制OC细胞前体分化,促进成熟OC发生凋亡2.OPG抑制破骨细胞分化成熟的机理为了研究OPG抑制OC分化、活化的分子生物学机理,在无血清培养条件下,采用M-CSF+RANKL联合诱导RAW264.7细胞分化为OC。在培养过程中加入不同浓度OPG（0、10、20、50、100ng/mL）进行处理。通过TRAP染色,OC内F-actin环染色,骨吸收陷窝分析等技术,研究OPG对OC的分化及活化的影响。此外,通过QRT-PCR技术检测OPG对OC相关基因TRAP、RANK、MMP-9、CA Ⅱ、Cathepsin K表达量的影响。结果显示,在无血清培养条件下,M-CSF+RANKL能够诱导OC的分化与活化,并能够促进OC分化及活化中TRAP、RANK、MMP-9、CAⅡ、Cathepsin K基因的表达,而OC的分化与活化受到OPG的抑制。3.OPG抑制破骨细胞分化成熟的MAPK信号转导机制为了研究OPG抑制OC分化中的MAPK信号转导机制,采用M-CSF+RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成OC,在体外培养不同时间,各组分别添加相应浓度的OPG。各时间点培养结束后收集细胞,提取总蛋白,通过Western blot法检测MAPK信号通路中关键信号蛋白的变化。结果发现,M-CSF+RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成OC过程中p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三种蛋白的磷酸化水平均上升,在诱导处理15min后p38-MAPK磷酸化水平达最大值,诱导处理30min后JNK-MAPK、ERK-MAPK磷酸化水平达最大值。不同浓度OPG均能够抑制p38-MAPK、JNK-MAPK、ERK-MAPK三种蛋白的磷酸化水平,且随OPG浓度的增加抑制作用更加明显。表明MAPK信号通路参与调控OC的分化与活化过程,且参与调控OPG抑制OC的分化与活化。4.OPG抑制破骨细胞分化成熟的Ca2+信号转导机制为了研究OPG抑制OC分化中的Ca2+信号转导机制,采用M-CSF+RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成OC,在体外培养不同时间,各组分别添加相应浓度的OPG。培养结束后收集细胞,通过流式细胞术检测OC胞内[Ca2+]i,通过Western blot法检测钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的磷酸化水平。结果发现,M-CSF+RANKL诱导RAW264.7细胞分化形成OC过程中OC胞内[ca2+]i极显著升高（P<0.01）,CaMKIⅠ激酶磷酸化水平上升,而OPG能够降低OC胞内[Ca2+]i,并下调CaMKIⅠ激酶的磷酸化水平。表明Ca2+信号通路参与调控OC的分化与活化过程,且参与调控OPG抑制OC的分化与活化。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 综述
• 第一章 骨骼与骨代谢
• 1 骨骼
• 2 骨骼内的细胞
• 2.1 骨细胞
• 2.2 成骨细胞
• 2.3 破骨细胞
• 2.4 成骨细胞与破骨细胞的联系
• 2.5 骨骼重建及调控
• 3 OPG,RANKL,RANK与骨代谢
• 3.1 OPG对破骨细胞活性抑制及其在骨骼疾病中的运用
• 3.2 RANKL/RANK在破骨细胞分化及活化和凋亡中的信号转导机制
• 2+信号通路与破骨细胞'>第二章 MAPK及Ca²⁺信号通路与破骨细胞
• 1 MAPK信号通路与破骨细胞
• 1.1 MAPK信号通路
• 1.2 MAPK信号通路在破骨细胞分化、活化及存活的作用
• 2+信号通路与破骨细胞'>2 Ca²⁺信号通路与破骨细胞
• 2+信号通路的激活'>2.1 破骨细胞中Ca²⁺信号通路的激活
• 2.2 CaMKⅡ激酶在破骨细胞分化中的作用
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第一章 OPG对破骨细胞分化、活化及凋亡的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要化学试剂
• 1.4 破骨细胞分离及培养
• 1.5 破骨细胞鉴定
• 1.6 统计分析
• 2 结果
• 2.1 OPG对体外培养鸭胚破骨细胞数量的影响
• 2.2 OPG对鸭胚破骨细胞骨架结构与胞核的影响
• 2.3 OPG对鸭胚破骨细胞骨吸收活性的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 OPG抑制破骨细胞分化成熟的机理
• 1 材料和方法
• 1.1 实验细胞株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要化学试剂
• 1.4 RAW264.7细胞培养
• 1.5 MTT法分析OPG对RAW264.7细胞活力的影响
• 1.6 破骨细胞TRAP染色及计数
• 1.7 破骨细胞骨架F-actin染色
• 1.8 牛皮质骨片吸收陷窝的检测
• 1.9 实时荧光定量PCR技术检测破骨细胞分化及活化相关基因表达水平
• 1.10 统计分析
• 2 结果
• 2.1 OPG对RAW264.7细胞活力的影响
• 2.2 OPG对破骨细胞分化的抑制作用
• 2.3 OPG对破骨细胞F-actin环形成的影响
• 2.4 OPG对破骨细胞骨吸收能力的影响
• 2.5 OPG对破骨细胞分化与活化过程中相关基因表达水平的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 OPG抑制破骨细胞分化成熟的MAPK信号转导机制
• 1 材料和方法
• 1.1 实验细胞株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要化学试剂
• 1.4 RAW264.7细胞培养及分组
• 1.5 Western blot法检测MAPK信号通路中关键信号蛋白的变化
• 2 结果
• 2.1 OPG作用不同时间对MAPK信号通路的影响
• 2.2 不同浓度OPG对MAPK信号通路的影响
• 2.3 MAPK信号通路特异性抑制剂对信号蛋白磷酸化水平的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 2+信号转导机制'>第四章 OPG抑制破骨细胞分化成熟的Ca²⁺信号转导机制
• 1 材料和方法
• 1.1 实验细胞株
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要化学试剂
• 1.4 RAW264.7细胞培养及分组
• 2+]_i'>1.5 流式细胞术（flow cytometry）测定破骨细胞分化过程中的[Ca²⁺]_i
• 1.6 Western blot法检测破骨细胞分化过程中CaMKⅡ激酶的磷酸化水平
• 1.7 统计分析
• 2 结果
• 2+]_i的影响'>2.1 OPG与2-APB对破骨细胞分化过程中[Ca²⁺]_i的影响
• 2.2 OPG与KN93对破骨细胞分化过程中CaMKⅡ激酶磷酸化水平的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文