伪狂犬病毒受体基因nectin-1的转基因研究

论文摘要

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）可引起野生动物和多种家畜的伪狂犬病,尤其是猪伪狂犬病,给中国乃至世界养猪业都造成了巨大的经济损失。与其它α-疱疹病毒亚科的成员一样,伪狂犬病具有神经嗜性和潜伏感染等特征,是一种具有重要研究意义的动物病毒性传染病。目前,预防和控制该病的主要措施仍然是免疫接种疫苗。虽然它可以减少潜伏感染的建立,但是却不能完全阻止病毒的感染和散毒,也不能阻止建立潜伏感染。若要是能够从动物自身的角度出发,培育出具有抗伪狂犬病的转基因动物,无疑对养殖业来说,是划时代的进步。PRV基因组编码膜蛋白与其它疱疹病毒相似,gD基因的质粒作为免疫原可以诱导细胞毒性淋巴细胞反应,是伪狂犬病毒入侵靶细胞所必需的一种糖蛋白。Nectin-1基因是α疱疹病毒的受体,介导伪狂犬病毒进入猪的上皮细胞和神经细胞。Nectin-1的N端有一个类似免疫球蛋白的结构域,该结构域与伪狂犬病毒糖蛋白基因gD相结合,进而导致病毒囊膜与细胞膜融合,核衣壳进入细胞,造成机体感染发病。所构建的转基因动物模型,正是利用nectin-1的这一特点,首先使转基因动物表达nectin-1基因胞外区的可溶性片段,在伪狂犬病毒感染细胞前先与gD基因竞争性结合,阻断gD基因与细胞上的nectin-1基因受体相结合,从而达到阻止伪狂犬病毒感染细胞的目的,增强转基因动物抗伪狂犬病的能力。鉴于以上研究背景,本试验分别通过转染和转导的方法获得表达nectin-1基因胞外区可溶性片段的PK-15细胞系,为构建具有抗伪狂犬病的转基因猪模型奠定基础。主要工作包括：1.PRV受体nectin-1基因的克隆与分子特征分析本试验根据GenBank上已登录的猪nectin-1基因序列（登录号AF308632）,设计1对引物P1、P2,本试验首先运用RT-PCR的方法从猪肝脏组织中克隆到了猪nectin-1基因,并采用生物信息学软件对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪nectin-1基因与犬、人、恒河猴、黑猩猩、家鼠、牛、马的nectin-1基因核苷酸序列同源性分别为92%、92%、91%、91%、89%、93%和93%；推导氨基酸序列的同源性分别为100%、95%、67%、100%、100%、100%和100%。在执行功能的胞外区具有很高的保守性,序列分析中的3个N-糖基化位点和7个半胱氨酸残基都位于胞外区,且在不同物种间也都具有很高的保守性,这从一定程度上解释了PRV可感染猪、羊、牛、猫、犬等35种脊椎动物,具有宿主范围广的原因。也为后期利用nectin-1胞外区来生产抗伪狂犬病毒的转基因动物提供了理论依据。2.猪nectin-1胞外区基因的克隆与原核表达本试验同样运用Prime 5软件设计1对引物P3、P4,以从猪肝脏组织中提取总RNA为模板,RT-PCR扩增猪nectin-1胞外区完整编码区序列,并将其克隆至pGEX-6p-1原核表达载体,成功构建pGEX-6p-1-nectin-1-ecto质粒,在IPTG 37℃条件下诱导表达3h后,在大肠杆菌BL21表达体系中,表达猪的nectin-1胞外区基因的蛋白。SDS-PAGE电泳检测可以得到一条大小约62kDa的与GST标签相融合的表达条带,并且主要以不溶性的包涵体形式存在。再以抗6个组氨酸的单抗为一抗,通过Western blot检测证实了表达蛋白的特异性后,以表达产物为抗原免疫3只新西兰白兔,制备nectin-1-ecto的多克隆抗体。40天后动脉放血采集少量血清,通过ELISA试验测定其效价为1：640。3.表达猪nectin-1胞外区基因的PK-15细胞系的构建构建了表达猪nectin-1胞外区基因的真核表达质粒pCA-nectin-1-ecto,运用脂质体法转染PK-15细胞,并在3周内用G418来筛选稳定表达猪nectin-1胞外区的PK-15细胞系。并采用流式细胞仪、间接免疫荧光和Western blot从蛋白质水平上证实猪nectin-1胞外区基因在所构建的细胞系中获得表达。在PK-15细胞系抑制PRV病毒增殖试验中,跟正常PK-15细胞相比较,所筛选的PK-15细胞系具有明显的抑制PRV病毒增殖的能力。4.慢病毒转导的PK-15细胞系的构建在众多逆转录病毒载体中,本试验运用HIV慢病毒载体作为构建转基因动物的载体。同时利用293ft细胞做为制备慢病毒粒子的包装细胞。本试验在转染293ft包装细胞时,同时转染除携带有外源目的基因pLenti-7.3CA质粒之外的另外三个辅助质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG,使其表达四个H1V慢病毒的结构基因。通过在包装细胞中装配后分泌到细胞上清中,收集细胞上清、超离获得HIV慢病毒粒子。将超离获得慢病毒病毒粒子按照5×108pfu/ml,用低速离心的方法转导PK-15细胞,72h后通过倒置式荧光显微镜观察,挑取阳性细胞克隆扩大培养,从而获得慢病毒转导的能够稳定表达猪pLenti7.3CA-nectin-1-ecto的PK-15细胞系。5.两种细胞系抑制病毒增殖实验的比较本试验通过接毒试验、一步法增长曲线试验和Western blot方法三个方面来验证两种细胞系抑制病毒的增殖试验。在接毒试验中,两种PK-15细胞系与正常的PK-15细胞系比较,具有明显的抑制病毒增殖的作用。而两种细胞系之间相比较,差异性并不明显。在一步法增长曲线试验中,将正常PK-15细胞和用上述两种方式成功构建的PK-15细胞系按照相同的量各培养于7瓶T-25细胞瓶中,24h后接种5MOI计量的病毒浓度为1×108的PRV-Ea株的病毒,按照Oh、3h、6h、12h、18h、24h共7个时间点,收集上述三种细胞的细胞上清液。测定毒价,发现通过慢病毒转导法获得的PK-15细胞系在第9h开始有效的抑制病毒的增殖,而用转染法获得的PK-15细胞系在第12h才开始对PRV的增殖有抑制作用。利用Western blot方法验证转染和转导空载体的PK-15细胞和用上述两种方式成功构建的PK-15细胞系相关蛋白表达量的情况。检测结果显示：在36 kDa处,两种细胞系的上清液都大量表达了目的蛋白,并且在57 kDa处也少量表达了细胞自身的nectin-1全蛋白,而转染和转导空载体的PK-15细胞,仅仅只在57 kDa处有少量nectin-1全蛋白表达。以上结果更近一步说明两种细胞系抗病毒的效果,并且两者之间的差异不显著。6.慢病毒载体在转基因动物中的试验本试验采用慢病毒感染法,选取湖北白猪,采用怀孕母猪自体移植的方式,将上述获得的慢病毒病毒粒子按照6×108pfu/ml的慢病毒浓度,4-5pL/胚的剂量,用超显微注射的方法注射到受精卵的卵周隙中,一共成功注射了153枚胚,并移植到6头受孕猪体内。2个月后,母猪全部流产,未能获得存活的转基因猪。取6头流产胎儿组织样品中的DNA,用PCR检测显示无阳性转基因猪产生。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第1章 文献综述
• 1.1 伪狂犬病对家畜的影响
• 1.1.1 历史上的发现
• 1.1.2 在非自然宿主中伪狂犬病感染的致死性
• 1.1.3 伪狂犬病的世界分布
• 1.2 病毒的分类
• 1.2.1 病毒的命名
• 1.2.2 疱疹病毒和α-疱疹病毒
• 1.3 PRV的分子生物学特性
• 1.3.1 病毒粒子的结构
• 1.3.2 囊膜蛋白
• 1.3.3 PRV对猪的急性感染
• 1.4 疱疹病毒受体nectin-1的一般生物学特性
• 1.4.1 细胞黏附分子
• 1.4.2 免疫球蛋白超家族
• 1.4.3 Nectin-1的定义及其细胞黏附作用
• 1.5 转基因动物研究简介
• 1.5.1 转基因技术的概念
• 1.5.2 转基因技术的发展
• 1.5.3 常用的动物转基因技术
• 1.6 转基因动物的应用与展望
• 1.6.1 转基因动物的概念
• 1.6.2 转基因技术在动物育种中的应用
• 1.6.3 转基因动物在医药科学研究中的应用
• 1.6.4 转基因动物研究存在的问题
• 第2章 研究目的和意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 病毒、细胞和菌株
• 3.1.2 载体与质粒
• 3.1.3 工具酶、主要试剂和试剂盒
• 3.1.4 主要培养基的配制
• 3.1.5 主要缓冲液的配制
• 3.2 实验动物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 RNA的提取
• 3.3.2 RT-PCR
• 3.3.3 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
• 3.3.4 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
• 3.3.5 大肠杆菌感受态细胞制备
• 3.3.6 连接产物的转化
• 3.3.7 质粒的小量制备
• 3.3.8 质粒的大量制备
• 3.3.9 重组质粒（阳性质粒）的鉴定
• 3.3.10 诱导表达
• 3.3.11 SDS-PAGE电泳
• 3.3.12 Western blotting
• 3.3.13 包涵体提取
• 3.3.14 多克隆抗体的制备
• 3.3.15 ELISA试验
• 3.3.16 脂质体介导的细胞转染
• 3.3.17 稳定表达细胞系的建立
• 3.3.18 提取PK-15细胞总蛋白
• 3.3.19 病毒的增殖
• 3.3.20 病毒滴度（PFU）的测定
• 3.3.21 病毒生长曲线的测定（一步法增殖曲线）
• 3.3.22 超离获取慢病毒粒子
• 3.3.23 用超离法转导PK-15细胞
• 3.3.24 用慢病毒感染法获取转基因猪
• 3.3.25 从转基因猪胚胎组织中提取高分子量DNA（无酚/氯仿法）
• 3.3.26 统计软件
• 第4章 结果与分析
• 4.1 猪nectin-1的克隆、测序及序列分析
• 4.1.1 猪nectin-1的RT-PCR扩增
• 4.1.2 猪nectin-1序列测定及分析
• 4.1.3 同源性比较及系统发育树绘制
• 4.1.4 跨膜区预测
• 4.2 猪nectin-1胞外区在大肠杆菌中的表达
• 4.2.1 猪nectin-1胞外区的PCR扩增
• 4.2.2 pGEX-6p-1-nectin-1-ecto原核表达质粒的构建
• 4.2.3 猪nectin-1-ecto融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 4.2.4 猪nectin-1-ecto原核表达产物的Western blot分析
• 4.2.5 猪nectin-1-ecto融合蛋白的纯化和多克隆抗体的制备
• 4.3 稳定表达猪nectin-1-ecto的PK-15细胞系的构建
• 4.3.1 pCA-nectin-1-ecto真核表达质粒的构建
• 4.3.2 稳定表达猪nectin-1-ecto的PK-15细胞系的构建
• 4.3.3 间接免疫荧光检测猪nectin-1-ecto在PK-15细胞系中的表达
• 4.3.4 Western blot检测猪nectin-1-ecto在PK-15细胞系中的表达
• 4.3.5 猪nectin-1-ecto稳定表达PK-15细胞系抑制病毒增殖实验
• 4.4 慢病毒转导的PK-15细胞系的构建
• 4.4.1 pLenti7.3CA重组质粒的构建
• 4.4.2 pLenti7.3CA-nectin-1-ecto真核表达质粒的构建 #43.
• 4.4.3 慢病毒病毒粒子的获取
• 4.4.4 慢病毒转导的PK-15细胞系的筛选
• 4.5 两种细胞系抑制病毒增殖试验的比较
• 4.5.1 两种细胞系抑制病毒增殖试验
• 4.5.2 两种细胞系一步法增殖曲线试验
• 4.5.3 两种细胞系的蛋白量表达情况
• 4.6 慢病毒载体重组质粒在转基因动物中的试验
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 PRV受体nectin-1基因的克隆与分子特征分析
• 5.1.2 猪nectin-1胞外区基因的克隆与原核表达
• 5.1.3 表达猪nectin-1胞外区基因的PK-15细胞系的构建
• 5.1.4 慢病毒转导的PK-15细胞系的构建
• 5.1.5 两种细胞系抑制病毒增殖试验的比较
• 5.1.6 慢病毒载体重组质粒在转基因动物中的试验
• 5.2 结果
• 5.3 结论
• 参考文献
• 致谢