液相芯片技术在中枢神经系统感染性疾病诊断中的应用研究

论文摘要

中枢神经系统感染性疾病是由多种病原体（病毒、细菌、真菌、寄生虫、朊病毒等）所引起的中枢神经系统常见和多发性疾病。严重的神经系统感染进展迅速,死亡率高,或留下严重的后遗症。为了降低该类疾病的死亡率和提高治愈率,这时对患者脑脊液中的病原体进行早期、快速的检测鉴定就显得十分重要了。早期、准确的诊断可以帮助临床医生及时给予病人有效的药物治疗。目的:目前,病原体的诊断方法主要依赖于脑脊液染色镜检,病原体培养,PCR技术等。但是,传统的检测方法受多种客观因素的影响,达不到早期、快速、准确诊断的目的。液相芯片技术具有高通量、准确、快速、灵敏、特异、可定性定量检测等显著优点。在本研究中,我们基于液相芯片技术建立一种能够早期、快速、高通量检测多种病原体的诊断方法。方法:本实验以脑膜炎和脑炎常见的5种病原体（结核分枝杆菌、新生隐球菌、肺炎链球菌、单纯疱疹病毒1,2型）为研究对象。我们通过选择5种病原体的特异性基因,从GenBank获得保守基因序列,进行序列比对,保证其特异性。应用oligo6.65设计特异性引物及寡核苷酸探针,通过生物信息学分析和试验验证,筛选出针对五种病原体的5对特异性引物及相应的探针。首先用5’-H2NC12标记的寡核苷酸探针包被编码微球作为反应载体,然后将各种探针荧光微球混合,制作悬浮芯片。该技术通过探针与单重或多重PCR扩增片段的杂交反应,来验证检测的特异性和敏感性。最后,通过对临床脑脊液标本的检测,评估液相芯片技术应用于临床检测的可行性。结果:在实验中,我们用设计的引物分别单重扩增五种病原体核酸,PCR扩增结果提示五对引物的设计是合适的,均可以实现对目的基因片段的有效扩增。为了保证多重扩增的一致性和稳定性,确定最佳反应条件,需要对多重PCR的反应条件进行优化,最终选择55℃为适宜的退火温度,该温度能够兼容五对引物的同时扩增。液相芯片技术检测的杂交条件优化包括杂交温度和杂交时间的确定,优化后的杂交温度为55℃,杂交时间为20min。本实验所建立的五重检测体系,可同时对结核分枝杆菌、新生隐球菌、肺炎链球菌、单纯疱疹病毒1,2型进行检测。检测结果与PCR验证实验结果一致,实验证实了基于液相芯片技术的五重检测体系是可行的。通过对结核分枝杆菌、肺炎链球菌和单纯疱疹1型病毒的敏感度检测,敏感度可达到fg级。其中结核分枝杆菌的检测敏感度为224 fg/μl,肺炎链球菌的敏感度为55 fg/μl,单纯疱疹1型病毒为35 fg/μl。我们还利用液相芯片技术检测了41例确诊为结核性脑膜炎患者的CSF标本,检出39例阳性,与检测的“金标准”相比较,符合率为95.1%;结核随访阴性的17例CSF标本中无一例被检出;另外从疑似结核性脑膜炎的CSF标本中检出6例;同时对20例已确诊的隐球菌感染患者CSF标本进行检测,检出19例,与隐球菌诊断的金标准比较,本方法检测的符合率为95%。结论:基于液相芯片技术的多重检测技术平台能够实现对中枢神经系统感染性疾病病原体的早期筛查。这种快速、敏感、高通量分析的方法可以为病原体的常规检测手段提供有价值的补充。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 一、直接涂片染色镜检法
• 二、病原体培养
• 三、聚合酶链反应
• 四、DNA 探针
• 五、生物芯片技术
• 实验一 基于液相芯片技术多重检测5 种病原体方法的建立
• 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 液相芯片技术对临床脑脊液标本的检测
• 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢