MicroRNA的检测方法研究

论文摘要

microRNA（miRNAs）是一类长度为19-25个核苷酸的内源性、非编码小RNA,其广泛存在于动植物中。这些高度保守的miRNAs通过结合mRNA的3’非翻译区来调节基因表达,miRNAs促进靶mRNA的降解和通过与靶mRNA形成复合二聚体抑制相应蛋白质的翻译被认为是最主要调节基因表达的机制。但是目前仍需做更多的研究探索miRNAs调节的精确机制。近年研究发现,miRNAs在动植物细胞代谢和分化,DNA损伤,细胞凋亡和肿瘤发生等一系列细胞生物学行为中发挥着重要的调节作用。最重要的是,现有的研究表明miRNAs表达水平的改变与多种疾病相关,这意味着miRNAs将有巨大的潜力成为诊断标志物和癌症治疗的靶向。为了更深入地研究miRNAs的功能,需要一种能够快速、灵敏、特异地检测出miRNAs在不同组织、不同器官、不同发育阶段的表达状况的检测方法。miRNAs在不同物种和组织中表达水平差异很大,因此需要一种能准确定量相应组织器官中miRNAs的方法,同时miRNAs序列很短且序列同源,给发展超灵敏度的检测方法带来了挑战。Northern blot是国际上公认的miRNAs检测的“金标准”方法,在此基础上建立了很多衍生方法,但是这类方法检测前必须事先准备大量的总RNA样本,且检测过程冗长,技术相对复杂,对检测人员专业程度要求相对较高,所以限制了其应用。最近介绍了多种不同的检测方法,但是它们都要求高级的信号检测系统,在普通实验室不易开展,且其特异性水平不太稳定。本研究建立了一种以核酸碱基互补配对识别结合为基础,经银染增强的纳米金标记探针的miRNAs检测方法,该方法简单易行,无需放射,荧光等昂贵设备就可获得高灵敏度,高特异性的检测信号,为miRNAs的研究开辟了新途径。同时,我们研究设计了一种基于miRNAs自引物扩增的miRNAs检测方法,该方法新颖,快速,简单易行,检测限达到100pg的组织总RNA,线形范围广达7个数量级,因而该方法有望得到推广应用。第一部分应用纳米金探针技术检测MicroRNA目的:本部分旨在建立一种基于银染增强的纳米金探针检测miRNAs的方法。方法:纳米金颗粒标记巯基修饰的寡核苷酸探针,纳米金探针随后与靶miRNAs杂交,生物素标记的捕获探针再与靶miRNAs杂交形成一个一端标记纳米金颗粒,一端标记有生物素的杂交双链。随后转移该杂交产物于链酶亲和素包被的酶标板中,经孵育后,杂交产物通过链酶亲和素-生物素特异识别系统固定在酶标板上。1×PBS和2×PBN溶液洗涤以去除酶标板中游离的纳米金探针,随后银染增强放大检测信号,经酶标仪在630nm波长处对银染增强液的OD值进行检测,溶液OD值变化的程度与纳米金颗粒量的多少有关,而纳米金颗粒的量取决于miRNAs的浓度。根据miRNAs的浓度和OD值之间的关系,绘制出相应的时间-剂量-效应关系曲线。结果:在一定的时间范围内,溶液的OD值与miRNAs的浓度相关,在反应过程中,miRNAs浓度越高,溶液的OD值变化程度越明显。而在无miRNAs的阴性对照中,溶液OD值则无明显的变化。通过对靶miRNAs浓度和相应的OD值的分析,可以得出miRNAs的剂量-效应关系曲线,在一定的反应时间点和一定的浓度范围内（10pM～10fM）,靶miRNAs的浓度与OD值之间具有很好的线性关系（R2=0.9906）。利用本方法能够检测到的合成miRNAs的最低浓度是10fM。且能够在低致10fM浓度水平,检测出单核苷酸错配序列间的差异。结论:纳米金银染增强检测miRNAs技术是一种灵敏,特异,简单,快速,经济的检测方法,有望能够应用于大多数生物样本的检测。第二部分自引物扩增技术检测microRNA目的:本部分旨在建立一种基于miRNAs作为自身引物从而扩增放大信号的一种miRNAs检测方法。方法:本方法利用长约60个nt的合成模板寡核苷酸序列和工具酶（DNA聚合酶与RNA聚合酶）在适当的反应条件条件下实现miRNAs的自引物扩增（self-primer amplification, SPA）。该模版寡核苷酸序列在3’端和5’端分别为两个相同的与靶miRNAs的碱基互补的序列,在两端序列中间则插入了一个启动子序列。靶miRNAs互补结合模板寡核苷酸形成不完整双链,然后Taq DNA聚合酶以合成寡核苷酸为模板催化miRNAs延伸形成完整双链,随后RNA聚合酶在启动子下游转录出序列与靶miRNAs一致的RNA序列,转录出的RNA序列又作为底物进入下一次扩增,如此反复循环,在等温条件下实现miRNAs的扩增,在转录过程中经SYBR Green检测出扩增信号。结果:SPA方法的最低检测限为1fM的合成miRNAs,从1fM到1nM 7个数量级范围内呈现了较宽的动态范围,靶miRNAs的浓度的对数值和CT值间存在明显的线形关系（R2=0.9849）,阴性对照没有检测到明显的信号。用于肝脏miR-122a的检测时,最低检测限是0.1ng的组织总RNA。结论:虽然在通量方面尚有待改善提高,但是基于miRNAs自引物扩增的分子生物学检测技术是一种灵敏度好,特异性好,成本低,设计灵活的检测方法,同样适合用于其它如siRNA等小分子RNA样本的检测。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 应用纳米金探针技术检测 MicroRNA
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 自引物扩增技术检测 MicroRNA
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 MicroRNA 与癌症（综述）
• 致谢