绿针假单胞菌GP72中2-羟基吩嗪（2-OH-PHZ）生物合成分子机理研究

论文摘要

绿针假单胞菌GP72（Pseudomonas chlororaphis GP72）,是从上海郊区甜椒根际土中分离筛选到的一株具有生物防治功能的假单胞菌属菌株,其分泌的吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxilic acid, PCA）和2-羟基吩嗪（2-hydroxyphenazine,2-OH-PHZ）等抗生素对植物病原真菌等具有有效抑制作用。本课题主要针对GP72中PCA的次级代谢产物2-OH-PHZ的合成机理,首次研究了它的生物合成途径中关键基因phzO的功能。PhzO蛋白酶是一种大小约55KDa的单脱氧酶,能够将PCA转化为2-OH-PHZ。同时,本课题还研究了phzE基因和PCA浓度对2-OH-PHZ生物合成的影响。首先,运用PCR技术从GP72菌株中克隆phzO基因,并通过重组和转化技术构建了该基因的过表达菌株。与野生菌株相比,phzO过表达菌株（GP72-pME6032-phzO）和对照组菌株（GP72-pME6032）生长稍次于野生型菌株。利用HPLC技术进一步监测phzO基因过表达对PCA和2-OH-PHZ合成的影响,发现phzO基因在GP72菌株中过表达未能显著提高2-OH-PHZ产量,而PCA产量较野生型菌株显著降低。论文进一步通过在DH5α中异源表达phzO,加入外源PCA分子作为反应底物,借助HPLC对反应产物进行检测,发现PhzO蛋白酶能够将底物PCA分子转化为2-OH-PHZ产物,从而证实了phzO的功能。其次,将克隆成功的phzO基因重组到假单胞菌M18菌株中,通过发酵实验验证M18菌株中phzE基因对2-OH-PHZ生物合成的影响。HPLC结果显示phzE基因对2-OH-PHZ的生物合成影响甚微。同时,实验证明了phzO基因跟PCA浓度对2-OH-PHZ的生物合成具有协同作用。本课题结果初步断定PCA转化为2-OH-PHZ的途径为一步反应,可由phzO单个基因完成。2-OH-PHZ的产量受前体PCA浓度及PhzO蛋白酶量协同影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 生物农药分类
• 1.2 生物农药的优越性
• 1.3 抗生素在生物防治中的作用
• 1.4 吩嗪类化合物
• 1.5 吩嗪衍生物合成基因及途径
• 1.6 植物根际促生细菌和假单胞菌
• 1.6.1 植物根基促生细菌介绍
• 1.6.2 假单胞菌介绍
• 1.7 绿针假单胞菌GP72 研究
• 1.8 PCA 转化为2-OH-PHZ 分子机理的研究进展
• 1.9 工作背景和意义
• 第二章 绿针假单胞菌GP72 基因phzO 扩增及分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 酶类及DNA Marker
• 2.1.3 主要培养基& 其他试剂
• 2.1.4 目的片段phzO 与载体pME6032 的制备
• 2.1.4.1 GP72 基因组DNA 的提取
• 2.1.4.2 聚合酶链式（PCR）反应
• 2.1.4.3 电泳定性检验DNA
• 2.1.4.4 PCR 产物的回收纯化及测序
• 2.1.4.5 提取载体质粒pME6032
• 2.1.4.6 双酶切质粒载体和phzO 片段
• 2.1.4.7 琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物
• 2.1.5 重组质粒pME6032-phzO 的构建及克隆
• 2.1.5.1 载体pME6032 与phzO 连接
• 2.1.5.2 DH5α感受态细胞的制备、转化
• 2.1.5.3 感受态细胞转化
• 2.1.5.4 双酶切鉴定重组质粒pME6032-phzO 和序列分析
• 2.1.6 生长曲线测定及2-OH-PHZ 提取和定量测定
• 2.1.6.1 菌体生长曲线测定
• 2.1.6.2 菌株的发酵培养条件
• 2.1.6.3 活性物质提取和测定方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 phzO 基因的验证和扩增
• 2.2.2 过表达重组质粒的构建
• 2.2.3 过表达菌株的获得
• 2.2.4 phzO 基因过表达对2-OH-PHZ 合成的影响
• 2.3 讨论分析
• 第三章 phzO 基因异源转化PCA 为2-OH-PHZ 研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 菌株和质粒
• 3.1.1.2 培养基和抗生素
• 3.1.1.3 DNA 常规操作技术
• 3.1.1.4 主要试剂
• 3.1.1.5 其他材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 PCA 的制备
• 3.1.2.2 重组菌的诱导表达
• 3.1.2.3 SDS-PAGE 鉴定表达产物
• 3.1.2.4 SDS-PAGE 检测表达产物位置
• 3.1.2.5 PhzO 蛋白酶异源转化PCA 为2-OH-PHZ
• 3.1.2.6 异源转化PCA 为2-OH-PHZ 条件探索
• 3.2 结果
• 3.2.1 PCA 的制备
• 3.2.2 PhzO 蛋白表达鉴定
• 3.2.3 PhzO 蛋白表达位置鉴定
• 3.2.4 PhzO 蛋白酶异源转化PCA 为2-OH-PHZ
• 3.2.5 异源转化PCA 为2-OH-PHZ 条件探索
• 3.3 讨论分析
• 第四章 外源基因phzE 及PCA 浓度对GP72 中2-OH-PHZ 产量影响研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 酶类及DNA Marker
• 4.1.3 主要培养基& 其他试剂
• 4.1.4 DNA 常规操作技术
• 4.1.5 假单胞菌M18-pME6032-phzO 菌株的获得
• 4.1.6 phzE 基因及底物PCA 影响2-OH-PHZ 产量实验
• 4.2 结果
• 4.2.1 假单胞菌M18-pME6032-phzO 菌株的获得
• 4.2.2 phzE 基因及底物PCA 对2-OH-PHZ 产量的影响
• 4.3 讨论分析
• 第五章 总结与展望
• 参考文献
• 附录1. 实验中所用的仪器设备
• 附录2. 菌株 GP72 phzO 测序结果
• 致谢