5个现代月季品种愈伤组织再生体系的建立与体细胞培养的研究

论文摘要

现代月季是世界上最重要的观赏植物之一,其四季常开、香味浓郁、花色丰富,一直为众人所青睐,具有广泛的应用价值,是现代城市绿化中不可替代的材料。我国北方由于气候原因,缺乏可以广泛栽培并能露地越冬的现代月季品种。当前在月季育种中存在的突出问题是现代月季遗传背景狭窄,传统育种方法周期过长,而且染色体数目及倍性差异造成远缘杂交不亲和与杂种的高度不育。生物工程则为生物品种的改造开辟了新途径。愈伤组织和体细胞是无性系变异和遗传转化的良好的受体材料,通过愈伤组织再生和体细胞培养可以获得无性系变异植株,而且体细胞融合为解决远缘杂交不育提供了一个很有潜力的新途径。但是现代月季再生途径的建立还存在很大的困难,而且体细胞培养难度很大,体细胞培养获得再生植株的报道还很有限,因此本研究对促进月季的抗寒育种及其他性状的改良都具有重要的意义。本研究通过探究影响现代月季快速繁殖和愈伤组织诱导再生的因素,并利用获得的愈伤组织建立细胞悬浮系,探讨了影响现代月季体细胞培养的各种因子,旨在建立起现代月季高效的快速繁殖体系、愈伤组织再生和体细胞培养技术体系,为以后导入抗寒等目的基因、体细胞无性系变异的筛选及原生质体培养和融合等遗传操作打下良好的基础。本研究的主要结果如下:1.建立了5个现代月季品种快速繁殖体系:1号月季品种不定芽萌发和增殖的最佳培养基为:MS+6-BA2.5mg·L-1+NAA0.05mg·L-1,增殖率能达到4.2;2号、6号和8号月季品种最佳培养基为:MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.05mg·L-1,增殖率分别能达到3.68、4.07和4.2;9号月季品种最佳培养基为:MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1 ,增殖率可达到3.99;5个月季品种无菌苗的最适生根培养基为:1/2MS+ NAA0.05 mg·L-1和1/2MS+ NAA 0.1mg·L-1,生根率都可达80%以上;各品种无菌苗通过驯化炼苗,露地栽植成活率都可达88%以上。2.筛选出5个现代月季品种愈伤组织诱导最佳培养基。1号、8号月季品种叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D3.0 mg·L-1,诱导率均可达到100.00%;2号、6号、9号月季品种叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D2.0 mg·L-1 +6-BA0.5 mg·L-1,诱导率分别可达到97.67%、98.67%、100.00%。1号、6号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D3.0 mg·L-1,诱导率分别可达到78.67%,84.33%;2号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D2.0 mg·L-1,诱导率可达到73.67%;8号、9号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2,4-D2.0mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1,诱导率分别为82.33%、80.33%。3.筛选出4个现代月季品种愈伤组织分化最佳培养基。1号品种叶片愈伤组织分化的最佳培养基为MS+2,4-D0.2 mg·L-1 +TDZ9.0 mg·L-1 +GA30.1 mg·L-1,分化途径为不定芽发生途径,分化率可达18.00%;6号品种叶片愈伤组织分化的培养基为MS+6-BA0.1 mg·L-1 +2,4-D1.0 mg·L-1 +TDZ8.0 mg·L-1 +GA30.1 mg·L-1,分化途径为不定芽发生途径,分化率可达22.00%;适合8号品种叶片愈伤组织分化的培养基为1/2MS+6-BA0.5 mg·L-1+TDZ10.0mg·L-1+GA30.1 mg·L-1、MS+2,4-D0.2 mg·L-1 +TDZ9.0 mg·L-1 +GA30.1 mg·L-1,前者愈伤组织分化途径为胚状体途径,胚状体通过继代培养可形成再生植株,后者分化途径为不定芽途径,分化率分别为18.67%、21.33%,幼茎愈伤组织分化的最佳培养基为MS+TDZ8.0 mg·L-1,分化途径为不定芽发生途径,分化率可达46.67%;9号品种叶片愈伤组织分化的最佳培养基为MS+6-BA0.1 mg·L-1 +TDZ9.0 mg·L-1 +GA30.5 mg·L-1,分化途径为不定芽途径,分化率达到16.67%,幼茎愈伤组织分化的培养基为MS+2,4-D0.2 mg·L-1 +TDZ9.0 mg·L-1 +GA30.1 mg·L-1,分化途径为胚状体途径,分化率可达35.33%。4.以5个月季品种的愈伤组织诱导培养基成分相同的液体培养基可建立起稳定的悬浮细胞系,悬浮系最佳的继代时间间隔为8-10d,悬浮系培养后4-8天内的细胞生长旺盛,活性强,适宜用来进行细胞系的再生培养;不同基因型间月季悬浮系生长特性差异不显著。5.以1号、8号和9号三个品种的悬浮细胞可诱导出愈伤组织。1号品种悬浮细胞在固体培养基MS+6-BA0.1 mg·L-1 +2,4-D1.0 mg·L-1 +KT0.1 mg·L-1,愈伤组织诱导率为22.00%;8号品种悬浮细胞在固体培养基MS+2,4-D1.0 mg·L-1 +NAA1.0 mg·L-1 +KT0.5 mg·L-1愈伤组织诱导率为27.33%;9号品种悬浮细胞在固体培养基MS+2,4-D1.0 mg·L-1 +NAA1.0 mg·L-1 +KT0.5 mg·L-1愈伤组织诱导率为26.67%,悬浮细胞在液体培养基MS+6-BA0.5 mg·L-1 +2,4-D1.0 mg·L-1 +NAA0.2 mg·L-1愈伤组织诱导率仅为2.67%。6. 1号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基MS+2,4-D0.2 mg·L-1 +TDZ9.0 mg·L-1 +GA30.1 mg·L-1上可直接分化出不定芽,分化率可达32.33%;8号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基MS+2,4-D0.2 mg·L-1 +TDZ9.0 mg·L-1 +GA30.1 mg·L-1上可分化出胚状体,分化率可达26.67%;9号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基MS + 6-BA0.1mg·L-1 + TDZ 9.0mg·L-1 + GA3 0.5mg·L-1上可分化出胚状体,分化率为38.67%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究的目的与意义
• 1.2 研究进展
• 1.2.1 植物组织培养技术概述
• 1.2.2 月季组织培养研究进展
• 1.2.3 植物体细胞培养研究进展
• 1.2.4 存在的问题
• 1.3 研究内容与技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试验仪器
• 2.1.3 培养基和培养条件
• 2.2 方法
• 2.2.1 现代月季快速繁殖体系的建立
• 2.2.2 愈伤组织的诱导
• 2.2.3 愈伤组织分化培养
• 2.2.4 细胞悬浮系的建立
• 2.2.5 细胞悬浮系的再生
• 3 结果与分析
• 3.1 月季快速繁殖体系的建立
• 3.1.1 丛生芽诱导结果
• 3.1.2 组培苗生根诱导与移栽
• 3.2 现代月季愈伤组织的诱导
• 3.2.1 叶片愈伤组织的诱导
• 3.2.2 幼茎愈伤组织的诱导
• 3.2.3 愈伤组织的显微观察
• 3.3 现代月季愈伤组织的分化
• 3.3.1 胚性愈伤组织的形成过程
• 3.3.2 基因型和外植体对愈伤组织分化的影响
• 3.3.3 培养基及激素对愈伤组织分化的影响
• 3.3.4 光照条件对愈伤组织分化的影响
• 3.3.5 愈伤组织状态对愈伤组织分化的影响
• 3.3.6 继代次数对愈伤组织分化的影响
• 3.4 细胞悬浮系的建立
• 3.4.1 细胞悬浮系的启动
• 3.4.2 细胞悬浮培养过程中PH 值的变化规律
• 3.4.3 细胞悬浮系的生长特性
• 3.5 细胞悬浮系的再生培养
• 3.5.1 悬浮细胞愈伤组织的诱导
• 3.5.2 悬浮细胞愈伤组织的分化培养
• 4 讨论
• 4.1 影响月季愈伤组织诱导和分化的因素
• 4.1.1 外植体与基因型
• 4.1.2 培养基和培养条件
• 4.2 愈伤组织的分化途径
• 4.2.1 器官发生途径
• 4.2.2 体细胞胚胎发生途径
• 4.2.3 类原球茎发生途径
• 4.3 现代月季体细胞培养的影响因素
• 4.3.1 悬浮培养起始物的选择
• 4.3.2 细胞培养与PH 的关系
• 4.3.3 振荡培养转速的影响
• 4.4 褐化现象的控制
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 英文缩写词表
• 攻读学位期间发表的学术论文