月季品种‘萨蔓莎’植株再生体系的建立和根癌农杆菌介导的遗传转化研究

论文题目: 月季品种‘萨蔓莎’植株再生体系的建立和根癌农杆菌介导的遗传转化研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 高莉萍

导师: 包满珠

关键词: 月季,乙烯,不定芽,愈伤组织,植株再生,根癌农杆菌,基因瞬间表达,氧化酶反义基因

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 月季是园林中应用最广的木本花卉之一,因其花朵美丽、四季开花、适应性广、耐修剪能力强,在我国广泛栽培。切花月季是世界四大切花之一,然而,月季切花的瓶插寿命相比于菊花、香石竹要短得多。近些年来,不少研究者围绕着月季切花衰老和保鲜问题进行了广泛的探讨,但最终未能从根本上解决问题。越来越多的研究结果表明在某些切花月季品种的开花和衰老过程中,乙烯合成呈现跃变型特征,外源乙烯处理加速花朵的衰老,而乙烯合成或作用抑制剂处理有利于延长花期,这些表现与乙烯跃变型切花非常相似。本研究的主要目标是通过农杆菌介导的遗传转化方法导入ACC氧化酶反义基因,利用反义RNA技术,抑制月季切花的乙烯合成,从而获得花期延长的月季植株。围绕这一目标,本研究以类似乙烯跃变型月季品种‘萨蔓莎’为试材,首先建立了该品种的离体微繁及植株再生体系,并就基因型、外植体类型、培养条件和植物生长调节剂等因素对月季叶片直接再生体系和间接再生体系的影响进行了详细的研究;然后利用GUS报告基因对影响根癌农杆菌介导月季遗传转化的条件作了深入探索,通过优化转化条件,建立了月季愈伤组织遗传转化体系;最后在此基础上进行ACC氧化酶反义基因的转化,并由PCR检测结果证明获得了月季‘萨蔓莎’转化的愈伤组织。本研究主要的研究结果如下: 1.建立了月季4个品种的离体微繁体系。以武汉地区市场效益较好的月季品种,包括红色系的‘萨蔓莎’、‘红衣主教’和黄色系的‘金奖章’、‘黄和平’为材料,建立其离体微繁体系。研究结果表明:初代接种材料的采集宜在春季的4～5月间进行,此时当年生枝条开始木质化,不容易失水,且经历了冬季低温,病虫害少,易于灭菌消毒:4个品种初代培养枝条上的腋芽在MS+0.5 mg/L BA+0.004mg/L NAA+0.1mg/L GA3培养基上培养2～3周后,可陆续萌发,萌芽率达70%左右;将幼芽切下后每4周一次继代在新鲜的扩繁培养基上,经过一定时间的适应过程,各品种试管苗的增殖效果都表现良好,其中,品种‘金奖章’和‘黄和平’相比于‘萨蔓莎’和‘红衣主教’需要经历更长的适应期;继代培养约4周后的枝条转入1/2MS+0.1mg/L IBA生根培养基中,20～30d后产生不定根;移栽成活的关键是生根试管苗的成熟程度,开始木质化的粗壮的试管苗移栽成活率高,约为80%,但幼嫩的试管苗因容易失水,抵抗力较差,而成活率低。 2.建立了月季品种‘萨蔓莎’直接器官发生途径的植株再生体系。分别以月

论文目录:

摘要

Abstract

缩略词表

1 文献综述

1．1 关于植株再生

1．1．1 器官发生途径

1．1．2 体细胞胚发生途径

1．2 月季植株再生的研究进展

1．2．1 月季器官发生途径的植株再生

1．2．2 月季体细胞胚发生途径的植株再生

1．3 关于植物遗传转化

1．3．1 农杆菌介导的植物遗传转化

1．4 月季遗传转化的研究进展

1．5 关于反义RNA技术

1．5．1 反义RNA

1．5．2 反义RNA技术的原理

1．5．3 反义RNA技术的应用

1．6 月季衰老与乙烯关系的研究进展

1．6．1 月季自然衰老过程中乙烯合成的变化

1．6．2 外源乙烯对月季开花和衰老的影响

1．6．3 乙烯合成和作用抑制剂对月季开花和衰老的影响

1．7 本研究课题的目的和意义

2 材料与方法

2．1 月季微繁体系的建立

2．1．1 植物材料

2．1．2 培养基

2．1．3 培养条件

2．1．4 试管苗的生根和移栽

2．2 月季不定芽直接再生体系的建立

2．2．1 基因型对植株再生的影响

2．2．2 外植体对植株再生的影响

2．2．3 叶位对植株再生的影响

2．2．4 暗培养天数对植株再生的影响

2．2．5 植物生长调节剂对植株再生的影响

2．3 月季间接再生体系的建立

2．3．1 小叶外植体愈伤组织的诱导

2．3．2 假珠芽的发生

2．3．3 可继代增殖愈伤组织的获得

2．3．4 愈伤组织的诱导分化

2．3．5 悬浮体系的建立

2．3．6 愈伤组织石蜡切片的制作

2．4 月季‘萨蔓莎’根癌农杆菌遗传转化体系的建立

2．4．1 植物材料

2．4．2 月季‘萨蔓莎’小叶对潮霉素的敏感性试验

2．4．3 月季‘萨蔓莎’愈伤组织对潮霉素的敏感性试验

2．4．4 根癌农杆菌菌株及质粒

2．4．5 根癌农杆菌的活化和工程菌液的制备

2．4．6 侵染和共培养

2．4．7 脱菌和选择培养

2．4．8 转化条件的优化

2．4．9 GUS基因瞬间表达的检测

2．4．10 试验培养基及各种试剂的配制

2．5 ACC氧化酶反义基因转化月季‘萨蔓莎’愈伤组织

2．5．1 植物材料、根癌农杆菌和质粒

2．5．2 转化和选择方法

2．6 抗性愈伤组织的PCR检测

2．6．1 愈伤组织DNA和质粒DNA的提取

2．6．2 PCR反应

3 结果与分析

3．1 月季微繁体系的建立

3．1．1 腋芽的萌发

3．1．2 试管苗的增殖

3．1．3 试管苗的生根和移栽

3．2 月季不定芽直接再生体系的建立

3．2．1 基因型对不定芽诱导的影响

3．2．2 外植体对不定芽诱导的影响

3．2．3 叶位对不定芽诱导的影响

3．2．4 暗培养天数对不定芽诱导的影响

3．2．5 植物生长调节剂对植株再生的影响

3．3 月季‘萨蔓莎’间接再生体系的建立

3．3．1 小叶外植体愈伤组织的诱导

3．3．2 假珠芽的发生

3．3．3 可继代增殖愈伤组织的获得

3．3．4 愈伤组织的诱导分化

3．3．5 悬浮体系的初步建立

3．4 月季‘萨蔓莎’遗传转化体系的建立

3．4．1 叶片对潮霉素的敏感性分析

3．4．2 愈伤组织对潮霉素的敏感性分析

3．4．3 外植体对遗传转化的影响

3．4．4 共培养培养基中盐浓度对愈伤组织遗传转化的影响

3．4．5 侵染时间对愈伤组织遗传转化的影响

3．4．6 共培养时光照条件对愈伤组织遗传转化的影响

3．4．7 共培养培养基的pH值对愈伤组织遗传转化的影响

3．4．8 共培养培养基中AS浓度对愈伤组织遗传转化的影响

3．4．9 菌液浓度、共培养温度和时间对愈伤组织遗传转化的影响

3．4．10 抗性愈伤组织的获得

3．4．11 抗性愈伤组织的GUS检测和PCR检测

3．5 含ACC氧化酶反义基因愈伤增殖的获得

4 问题与讨论

4．1 月季‘萨蔓莎’两种植株再生系统的比较

4．1．1 再生频率

4．1．2 遗传稳定性

4．1．3 外植体来源

4．1．4 对选择抗生素的敏感性

4．1．5 对农杆菌侵染的敏感性

4．2 影响月季‘萨蔓莎’愈伤组织遗传转化的因素

4．3 GUS基因瞬间表达和稳定转化之间的关系

4．4 关于本研究中转化系统的转化效率

4．5 本研究的下一步工作

参考文献

附录

致谢

发布时间: 2005-12-05

参考文献

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