论文摘要
第一部分胆固醇结石患者与正常人胆囊胆汁的比较蛋白质组学研究目的建立、优化胆囊胆汁总蛋白的蛋白质组学研究的技术平台,比较分析胆固醇结石患者与正常人胆囊胆汁蛋白表达谱的差异,筛选胆石成因相关蛋白质。方法提取胆固醇结石患者和正常人胆囊胆汁总蛋白,构建相应的双向电泳蛋白质表达谱,应用ImageMaster图像分析软件获得差异蛋白点信息,质谱鉴定差异表达蛋白质。结果胆固醇结石患者与正常人胆囊胆汁总蛋白浓度分别为（6.4824±0.3403）mg/ml和（2.3156±0.3064）mg/ml（P＜0.01）。两组组内蛋白质平均匹配点数分别为465±71和407±85,显著差异点34个,成功鉴定22个,其中15个在胆固醇结石患者胆囊胆汁中表达上调,7个下调。结论初步建立了胆固醇结石患者和正常人胆囊胆汁蛋白质表达谱,成功鉴定了22个差异蛋白质点,为筛选胆石形成关键调控子提供基础。第二部分胆汁泡相与微胶粒相的比较蛋白质组学研究目的采用比较蛋白质组学技术研究胆固醇结石患者胆囊胆汁的胆固醇-磷脂泡相与微胶粒相的蛋白质表达谱的差异,筛选与胆汁泡聚集、融合相关的蛋白质。方法运用甲泛葡胺为介质的密度梯度超速离心法制备胆汁泡相和微胶粒相,提取相应的总蛋白,构建相应的蛋白质表达谱,ImageMaster图像分析软件获得差异蛋白点信息,质谱鉴定差异表达蛋白质。结果胆汁泡相与微胶粒相蛋白质平均蛋白质点数分别为120±24和198±37,显著差异表达点为19个,成功鉴定8个,其中人血清白蛋白、乙醛还原酶、β-球蛋白、前白蛋白A链、视黄醇结合蛋白A链及触珠蛋白β链在泡相中表达上调,载脂蛋白A-Ⅰ、载脂蛋白A-Ⅱ前体表达下调。结论初步建立了胆固醇结石患者胆囊胆汁的胆汁泡相和微胶粒相蛋白质表达谱,分析、鉴定了差异蛋白质点,为筛选胆汁泡聚集、融合,胆固醇结石形成的关键调控蛋白质提供实验基础。第三部分差异表达蛋白质的再验证目的对比较蛋白质组学筛选出的差异表达蛋白质进行再验证,以保证初筛结果的可信度及进一步功能学研究的确定性。方法通过免疫组织化学技术验证HSA、RBP、TPM、CRT、PFN这5种差异表达蛋白在胆固醇结石患者和正常人的胆囊组织中的表达情况,运用Western Blot验证差异蛋白在两组人群的胆囊胆汁中和在胆固醇结石患者胆汁泡相和微胶粒相中的差异。结果免疫组织化学结果证实HSA、RBP及CRT在胆固醇结石组的胆囊组织中较正常对照组表达上调,PFN和TPM在胆固醇结石组的表达下调;Western Blot证实HSA、RBP及CRT在胆固醇结石组的胆囊胆汁中较正常对照组上调,其中HSA及RBP在胆汁泡相的表达水平高于微胶粒相。PFN和TPM在胆固醇结石组表达下调。结论免疫组织化学和Western Blot对差异表达蛋白质的再验证结果表明我们使用的2-DE、ImageMaster 2D Platinum 5.0 software分析、质谱鉴定等比较蛋白质组学研究技术平台的准确性、稳定性和结果可靠性。第四部分视黄醇结合蛋白促成核功能的初步研究目的观测RBP在体外模拟胆汁体系中的成核活性。方法构建Small和综合模拟胆汁体系,运用结晶生长试验法和Holan观测成核时间法,探讨RBP的促成核效应。结果结晶生长试验结果表明RBP的成核时间指数（It）为0.73,结晶生长速度指数（Ig）为1.02,结晶最终浓度指数（IC）为0.95;RBP组的成核时间在Small模拟胆汁体系中平均为（8.17±1.47）d,综合模拟胆汁体系中平均为（7.5±1.05）d,其可以促进胆固醇结石成核、结晶。结论RBP在体外模拟胆汁体系中具有促成核活性,为进一步研究其在胆固醇结石发病机制中的作用提供一定的实验依据。综上所述,本课题通过比较蛋白质组学技术建立了胆固醇结石组和正常对照组的胆囊胆汁的蛋白质表达谱,胆固醇结石患者胆囊胆汁的胆汁泡相和微胶粒相的蛋白质表达谱,分别筛选、成功鉴定出差异蛋白质点22个和8个,运用免疫组织化学和蛋白质免疫印迹技术进行了HSA、RBP、TPM、CRT、PFN5种差异表达蛋白的再验证,并对其中的RBP与胆固醇结石形成的关系进行了初步的研究。
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