人IgG1-Fc在昆虫表达系统中N-糖基化修饰的研究

论文摘要

昆虫杆状病毒表达系统能够对表达的重组糖蛋白进行N-糖基化修饰,具有潜在的表达高等哺乳动物N-糖基化修饰的功能蛋白的前景。该系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力,包括糖基化、磷酸化、信号肽切除及肽段的切割和分解等,修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况一致。对比实验证明,在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致,但修饰的寡糖种类不完全一样。这种不一致对不同目的蛋白的活性影响不同,所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。人IgG1是人体内非常重要的免疫球蛋白,其免疫功能与N-糖基化修饰有很大的关系。本课题利用昆虫杆状病毒表达系统表达了人IgG1中需要N-糖基化修饰的Fc片段。实验结果表明人IgG1-Fc在昆虫病毒系统得到较高水平的表达,通过糖苷酶PNGase F处理经Protein A纯化柱纯化的人IgG1-Fc,结果显示人IgG1-Fc的N297糖基化位点发生了N-糖基化修饰。这不仅有助于研究昆虫细胞糖基化机制,同时也为改造昆虫病毒表达系统来表达具有医学价值的糖蛋白奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 研究背景和选题意义
• 1.1.1 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统
• 1.1.2 昆虫和哺乳动物糖蛋白的N-糖链修饰异同
• 1.1.3 免疫球蛋白IgG 的基本结构
• 1.1.4 人IgG1-Fc 糖基化的生物学功能
• 1.1.5 糖蛋白的糖链结构分析技术
• 1.1.6 理论意义和实用价值
• 1.2 课题的主要内容
• 第2章 人IgG1-Fc 在昆虫表达系统中的表达与纯化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 人IgG1-Fc 基因的扩增
• 2.3.2 重组质粒FC-T 的鉴定
• 2.3.3 人IgG1-Fc 基因的序列及其分析
• 2.3.4 重组表达载体SP-Fc-P 的构建
• 2.3.5 重组SP-Fc-B Bacmid 的抽提与鉴定
• 2.3.6 重组杆状病毒的鉴定
• 2.3.7 Western blotting 对人IgG1-Fc 蛋白的检测
• 2.3.8 人IgG1-Fc 蛋白的纯化
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第3章 人IgG1-Fc 蛋白的N-糖基化鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 PNGaseF 对人IgG1-Fc 蛋白的N-糖基化鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第4章 人IgG1-Fc 蛋白的糖链结构分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 人IgG1-Fc 蛋白的糖链结构分析
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢