降钙素基因相关肽（CGRP）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的生物学效应及其机制研究

论文摘要

由于创伤、感染等各种原因造成的骨折、骨不愈合等一直是威胁人类生命健康的医学难题。对于从根本上提高其治疗效果而言,明确骨形成、重建、塑形的病理生理学特点及其生物学机制是其基础和出发点。骨组织是一种伴随着细胞外基质矿化、根据需要不断自我修复的复杂动态组织,亦是带有血管、神经支配的生物活性组织,因此,骨折修复过程中既有机体多种组织、细胞因子之间错综复杂的协同作用,更与血液供应、神经支配密切相关,其修复区域内环境的生物学稳定性尤其是血液供应和神经支配的重建是关键因素。血液供应的重建对于骨及移植物保持生物学活性的重要性已被众多实验及临床实践所证实,除此之外,骨组织再生中神经因素可能同样发挥着重要作用。骨骼系统是充满活力和不断重建的组织,由大量感觉神经元支配着。在周围神经系统中,降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide,CGRP）是主要的神经递质。大量文献证实CGRP具有促进骨代谢作用。在骨骼发育过程中,降钙素基因相关肽免疫阳性（CGRP-immunoreactive, CGRP-IR）周围神经在骨形成区域非常丰富；与此一致的是,骨折愈合时,可以看到神经纤维的生成。在成角骨折的模型中,Li et al发现在新骨生成特别多的区域,新形成的神经纤维也特别丰富,其血液中CGRP浓度也增高。CGRP-IR周围神经在骨代谢活性的部位如干骺端、骨膜、骨软骨结合处的生长板分布较为密集。骨组织的CGRP-IR神经纤维的数量在骨发育和修复过程中增加,提示它们直接参与局部骨重建的调节。CGRP基因敲除的小鼠表现为骨形成速率下降和骨丢失加速,化学和外科方法切除周围神经导致负重骨和非负重骨机械负荷能力下降。而在骨不连时,骨折残段CGRP-IR神经纤维明显缺失。当用辣椒素去除大鼠的无髓鞘感觉神经元的CGRP时,伴随着骨丢失和骨脆性增加。类似地,有着家族性植物神经失调综合征的病人,常导致无髓鞘神经元的破坏伴随着神经肽信号的减少,骨矿密度下降和骨脆性的增加。同时骨组织也是高度血管化的组织,血管形成是骨生成和发育过程中的关键步骤。骨骼发生及形成通过两条不同途径：膜内成骨和软骨内成骨。虽然是两种不同的成骨方式,它们有着共同的特征：形成血管是它们发生的先决条件。同时有活性的微脉管系统的形成和发育是骨重建和骨折愈合的必需过程,血管生成在骨折后骨再生的整个过程中起着主要作用,血管生成能恢复骨折部位的血流,能通过产生生长因子调节成骨细胞活性,募集干细胞和定向分化分成骨细胞以促进骨形成。因此显而易见的是,血管作为营养成分的主要供给者在骨的发育中起着关键作用。但是,血管不只是单单提供营养,有研究表明成骨祖细胞停留在人骨髓血管壁上,而当骨折伴随着严重的血管损伤,导致局部缺血时,会导致延迟愈合或不愈合。在行骨牵引时,急性牵引（产生过大的机械负荷）能中断血管生成过程,阻止骨生成和导致纤维性不愈合。TNP-470抑制新血管的形成能阻止大鼠的骨折愈合,相反,外源性添加外来的促血管生成因子时,能显著加速骨折愈合。而在骨组织中绝大多数CGRP-ir（?）神经纤维与血管伴行。我们实验室在前期研究发现植入周围神经能促进组织工程骨成骨及修复骨缺损,骨缺损部位的神经肽明显增加,且感觉神经束植入的组织工程骨内可见较多血管。由于CGRP-ir周围神经和血管生成在骨发育和修复中都具有不可或缺的作用。因此,周围神经和血管在骨修复及重建中有着什么样的关系?周围神经是否可通过促进骨组织的血管生成进一步促进骨修复和重建?本实验研究的是周围神经末梢释放的神经肽CGRP对血管内皮细胞的生物学效应及机制研究,以进一步明确周围神经在骨组织中的作用。研究目的●神经肽CGRP受体在HUVECs上的表达特点●明确神经肽CGRP调控HUVECs增殖和迁移的作用及其机制。●初步探明神经肽CGRP在HUVECs血管生成中的生物效应及机制。●比较CGRP与VEGF体外促HUVE Cs增殖、迁移、成管的作用大小第1部分人脐静脉血管内皮细胞的获取、鉴定以及其表面CGRP受体的表达目的：获取用于作为种子细胞的脐静脉血管内皮细胞,并对脐静脉血管内皮细胞表面特异性标记蛋白以及细胞上CGRP受体进行鉴定方法：1.人脐静脉血管内皮细胞的获取、鉴定用胰酶消化新生儿剖宫产脐带,用含20%FBS的内皮细胞生长培养基EMG-2在37°5%C02环境下培养消化下来的细胞,对细胞行形态学进行观察以及采用细胞免疫荧光对血管内皮细胞表面特异性标志物进行鉴定。2.脐静脉血管内皮细胞上CGRP受体的检测HUVECs在盖玻片上生长融合为单层后,以4%多聚甲醛固定30min,正常山羊血清封闭30min,分空白对照组和实验组,实验组加CGRP1受体,空白对照组不力（?）CGRP1受体,置于湿盒中4℃过夜,加入Dy Light594标记的山羊抗兔IgG,置于37℃中30min,以5μg/mL DAPI染核10min,缓冲甘油封片,于倒置荧光相差显微镜下观察。结果：成功分离培养出脐静脉血管内皮细胞,经鉴定符合血管内皮细胞特征,CGRP受体存在于血管内皮细胞上。结论：胰酶消化培养法获得的细胞为脐静脉血管内皮细胞,血管内皮细胞存在有CGRP受体。实验证实CGRP受体存在于脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）上,从而为进一步研究CGRP对血管内皮细胞的直接作用提供理论依据。第2部分降钙素基因相关肽对人脐静脉血管内皮细胞增殖和迁移的影响及机制研究目的：探讨降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide, CGRP）对人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）增殖与迁移的作用,进一步揭示组织工程骨的神经化促血管生成机制。方法：取第1代细胞用于实验。实验组分为6组,分别以0（A组）、1×10-12（B组）、1×10-11（C组）、1×10-10（D组）、1×10-9（E组）、1×10-8mol/L组（F组）浓度CGRP干预HUVECs.采alarmarBlue法动态检测各组HUVECs增殖率,Transwell小室检测各组HUVECs的迁移能力,ELISA法检钡（?）HUVECs分泌VEGF的水平,Q-PCR以及Western blot法监测其局部粘着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）的表达。结果：CGRP呈时间-浓度依赖性刺激HUVECs增殖；B-F组各时间点细胞增殖率均高于A组（P<0.05）,F组各时间点细胞增殖率最高。B-F组迁移细胞数均显著高于A组（P<0.05）,最大增幅达3倍以上。B-F组VEGF分泌量均显著高于A组（P<0.05）；C,D组促进细胞分泌VEGF的能力最强。Q-PCR示Western blot检测示,与A组相比,B-F组CGRP刺激HUVECs3、7、10d后,FAK表达明显增加（P<0.05）。结论：CGRP对HUVECs的增殖和迁移有直接促进作用,CGRP促进VEGF分泌和增加FAK的表达与此密切相关。第3部分CGRP促HUVECs体外血管生成的作用及其生物学机制目的：观察降钙素基因相关肽（Calcitonin-gene-related peptide, CGRP）对人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）成血管作用,并探讨其生物学机制。方法：体外分离获取HUVECs,采用体外成管实验检测CGRP的血管生成作用,采用ELISA法检测CGRP直接/间接作用于HUVECs时,VEGF的分泌水平。Q-PCR检测CGRP刺激细胞（3,7,10d）时,VEGF、VEGF受体1（FLT1）、 VEGF受体2（KDR）及CGRP受体1的mRNA表达,Western blot检测HUVECs的FLT1、KDR的蛋白表达。结果：体外成管实验显示CGRP有明显的促血管生成作用。ELISA显示CGRP能促进HUVEC分泌VEGF。Q-PCR示CGRP促VEGFmRNA与CGRPR1mRNA的表达在第10天时最为明显,而（10-8～10-12M）CGRP组的FLT1mRNA与KDRmRNA表达在3d、7d、10d时均比对照组高。Western blot结果显示（10-8～10-12M）CGRP组能显著促进HUVECs表达FLT1, KDR.结论：CGRP能明显促进HUVECs的体外生成血管,可能与其促进VEGF分泌,增强HUVECs的FLT1与KDR表达有关；且同时,CGRP的受体表达也增加,可进一步增强CGRP的促血管生成作用。第4部分CGRP与VEGF对内皮细胞体外成血管作用的比较目的：比较降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide, CGRP）与血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）对血管内皮细胞殖、迁移、体外成管的作用。方法：实验分9组,（10-12-10-8）MCGRP,（5-20ng/ml）VEGF165,另设置一个空白对照组。采用细胞免疫荧光观察HUVECs的CGRP受体（calcitonin gene-related peptide receptors, CGRPR）表达情况,alarmarBlue法动态检测各组HUVECs的增殖率,Transwell小室检测各组HUVECs的迁移能力。采用体外成管实验检测各组促血管生成作用大小。Q-PCR检测CGRP和VEGF165刺激细胞时,CGRP受体的mRNA表达情况。结果：CGRP及VEGF165时间-浓度依赖性促进HUVECs增殖,VEGF165促内皮细胞增殖的能力强于CGRP,差异有显著性。CGRP及VEGF165都能明显促进HUVECs迁移及促进HUVECs在基质胶中形成毛细血管样结构。并且两者的最大作用基本一样。CGRP与VEGF165都能促进内皮细胞中CGRP受体表达水平增加。但是CGRP促CGRP受体,生成作用明显强于VEGF165。结论：CGRP是强的促血管生成因子,其促血管生成的作用与低浓度（5-20ng/ml）VEGF165相当。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 人脐静脉血管内皮细胞的获取、鉴定以及其表面CGRP受体的表达
• 1. 材料和方法
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 参考文献
• 第二部分 降钙素基因相关肽对人脐静脉血管内皮细胞增殖、迁移的影响及其作用机制
• 1. 材料和方法
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4 讨论
• 5. 小结
• 参考文献
• 第三部分 CGRP促进HUVECs体外血管生成及机制探讨
• 1. 材料和方法
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 参考文献
• 第四部分 降钙素基因相关肽与血管内皮生长因子对内皮细胞成血管的作用比较研究
• 1 材料和方法
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 中英文缩略词表
• 攻读硕士学位期间研究成果
• 致谢
• 附件