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秦岭链霉菌开发利用的前期基础研究

2020-11-23阅读(279)

秦岭链霉菌开发利用的前期基础研究

论文摘要

秦岭链霉菌（Streptomyces qinlingensis sp.nov.）是作者从陕西秦岭土壤中分离的一株放线菌（No.24菌株）,其发酵产物对多种植物病原真菌和细菌具有强烈的抑制作用。本文对秦岭链霉菌菌株的分类地位、发酵产物的生物活性、发酵产物的稳定性、高产菌株选育、发酵条件优化进行了系统的研究。主要研究结果如下:（1）No.24菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分以及16SrDNA序列研究结果表明,No.24菌株与模式菌株Streptomyces maritimus（AY247716）的16SrDNA同源性为99%。但菌株在形态特征、培养特征、生理生化特征和细胞壁化学成分等方面均不同于模式菌株。No.24菌株在酵母膏培养基上产生浅黄色的可溶性色素,孢子表面光滑,而S.maritimus菌株不产生任何可溶性色素,孢子表面不光滑,No.24菌株细胞壁含二氨基庚二酸（LL-DAP）、甘氨酸和乳糖,而S.maritimus菌株细胞壁则含L-DAP;No.24菌株在含有5%NaCl的培养基中能良好生长,而S.maritimus菌株则不能在含有5%NaCl的培养基中生长;秦岭链霉菌能同时代谢杀虫和杀菌抗生素,而S.maritimus菌株则未见代谢任何抗生素的报道。因此,建议把该菌株命名为链霉菌属的一个新种,即秦岭链霉菌（Streptomyces qinlingensis sp.nov.）。（2）室内生测结果表明,秦岭链霉菌发酵产物不但对多种常见植物病原真菌具有较强的抑菌活性,而且对多种植物病原细菌和动物病原细菌也有良好的抑制作用,表现为广谱抗菌性。抑制菌丝生长速率法生测结果表明,秦岭链霉菌发酵产物对玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、苹果轮纹病菌（Macrophoma kuwatsukai）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）的EC50分别为238.95 mg/l,146.87 mg/l和164.09 mg/l;抑制孢子萌发法试验结果表明,秦岭链霉菌发酵产物对玉米大斑病菌和马铃薯干腐病菌（Fusarium coeruleum）的EC50分别为129.33 mg/l和184.99 mg/l。管蝶法生测结果表明,秦岭链霉菌发酵产物对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtills）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、水稻白叶枯病菌（Xathomonas oryzae pv.oryzae）和链球菌（Streptococcus）的抑菌圈直径分别为24mm,23 mm,19.8 mm和19.0 mm。盆栽试验结果表明,秦岭链霉菌发酵产物对小麦白粉病（Blumeria graminis）、黄瓜霜霉病（Pseudoperonospora cubensis）和番茄灰霉病（Botrytis cinerea）的保护效果分别为76.1%,63.9%和61.1%,治疗效果分别为70.8%,59.7%和66.9%。田间试验结果表明,秦岭链霉菌发酵产物对小麦白粉病、黄瓜霜霉病和番茄灰霉病的防治效果分别为52.73%,64.98%和74.95%。（3）以枯草芽孢杆菌为指示菌,测定了秦岭链霉菌发酵液的稳定性。发现发酵液对光照、热和酸均较稳定,加热到80℃仍不丧失活性,在pH2～6的1mol/l的HCl溶液

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 抗生素研究概况
  • 1.2 农用抗生素的研究概况
  • 1.2.1 国外农用抗生素研究概况
  • 1.2.2 国内农用抗生素的研究背景
  • 1.3 农用抗生素产生菌的筛选途径
  • 1.3.1 自然选育
  • 1.3.2 诱变育种
  • 1.3.2.1 紫外线诱变
  • 1.3.2.2 激光诱变
  • 1.3.2.3 微波诱变
  • 1.3.2.4 化学诱变
  • 1.3.3 筛选过程
  • 1.4 杂交育种
  • 1.4.1 常规杂交育种
  • 1.4.2 原生质体融合
  • 1.4.2.1 原生质体融合重组子的鉴别
  • 1.4.3 分子育种
  • 1.5 菌株高产发酵条件优化
  • 1.5.1 碳源
  • 1.5.2 氮源
  • 1.5.3 无机盐和微量元素
  • 1.5.4 温度
  • 1.5.5 通气量
  • 1.5.6 pH
  • 1.5.7 合成产物的反馈抑制
  • 1.5.8 前体及促进剂（刺激剂）的添加
  • 1.5.8.1 前体物质的添加
  • 1.5.8.2 促进剂（刺激剂）的添加
  • 1.6 论文设计思路
  • 1.6.1 选题的背景
  • 1.6.2 研究的内容和目的意义
  • 1.6.3 研究的技术路线
  • 第二章 秦岭霉素产生菌菌株的鉴定
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 供试菌株
  • 2.1.2 试剂
  • 2.1.3 仪器
  • 2.1.4 培养基
  • 2.1.4.1 形态和培养特征观察培养基
  • 2.1.4.2 生理生化特征观察培养基
  • 2.2 试验方法
  • 2.2.1 No.24 菌株的形态学观察
  • 2.2.2 No.24 菌株培养特征的观察
  • 2.2.3 No.24 菌株生理生化特征的试验
  • 2.2.3.1 碳源利用试验
  • 2.2.3.2 淀粉水解试验测定
  • 2.2.3.3 硫化氢产生试验测定
  • 2.2.3.4 纤维素利用实验测定
  • 2.2.3.5 明胶液化试验测定
  • 2.2.3.6 牛奶凝固与胨化试验测定
  • 2.2.3.7 硝酸还原试验测定
  • 2.2.4 细胞壁的化学成分分析
  • 2.2.4.1 氨基酸成分分析
  • 2.2.4.2 全细胞糖成分分析
  • 2.2.5 No.24 菌株的分子鉴定
  • 2.2.5.1 引物设计
  • 2.2.5.2 DNA 的提取
  • 2.2.5.3 DNA 的检测
  • 2.2.5.4 16S rDNA PCR 扩增
  • 2.2.5.5 DNA 的回收
  • 2.3 结果与分析
  • 2.3.1 形态特征
  • 2.3.2 培养特征
  • 2.3.3 生理生化特征
  • 2.3.4 细胞壁化学成分分析
  • 2.3.4.1 No.24 菌株的DNA 提取结果
  • 2.3.4.2 No.24 菌株系统发育树的构建
  • 2.4 讨论
  • 第三章 秦岭链霉菌发酵产物的生物活性
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 供试菌株及其来源
  • 3.1.2 供试病原菌
  • 3.1.3 发酵产物处理
  • 3.1.4 试验方法
  • 3.1.4.1 离体试验
  • 3.1.4.2 盆栽试验
  • 3.1.4.3 田间试验
  • 3.2 结果与分析
  • 3.2.1 离体活性
  • 3.2.1.1 对病原真菌菌丝生长的抑制作用
  • 3.2.1.2 对病原真菌孢子萌发的抑制作用
  • 3.2.1.3 对细菌的抑制作用
  • 3.2.1.4 盆栽试验结果
  • 3.2.1.5 田间防治效果
  • 3.3 讨论
  • 第四章 秦岭链霉菌发酵产物稳定性
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 供试菌株
  • 4.1.2 培养基
  • 4.1.2.1 斜面培养基
  • 4.1.2.2 发酵培养基
  • 4.1.2 培养方法
  • 4.1.3 发酵液的制备
  • 4.1.4 生物测定
  • 4.1.5 秦岭链霉菌菌株发酵液热稳定性测定
  • 4.1.6 秦岭链霉菌菌株发酵液酸碱稳定性测定
  • 4.1.7 秦岭链霉菌菌株发酵液光照稳定性测定
  • 4.1.8 秦岭链霉菌菌株发酵液紫外线稳定性测定
  • 4.2 结果与分析
  • 4.2.1 热稳定性测定
  • 4.2.2 酸碱稳定性测定
  • 4.2.3 光照稳定性测定
  • 4.2.4 紫外线照射稳定性测定
  • 4.3 讨论
  • 第五章 秦岭链霉菌的诱变选育
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 菌种
  • 5.2 培养基
  • 5.3 实验方法
  • 5.3.1 孢子悬浮液的制备
  • 5.3.2 紫外诱变
  • 5.3.3 化学诱变
  • 5.3.3.1 亚硝基胍（NTG）诱变
  • 5.3.3.2 EMS（甲基磺酸乙酯）诱变
  • 5.3.3.3 NTG+EMS 诱变
  • 5.3.4 微波诱变
  • 5.3.5 超声波诱变
  • 5.3.6 生物活性测定
  • 5.3.7 遗传稳定性试验
  • 5.4 结果与分析
  • 5.4.1 秦岭链霉菌菌株紫外线诱变结果
  • 5.4.2 秦岭链霉菌化学诱变结果
  • 5.4.3 秦岭链霉菌的微波诱变结果
  • 5.4.4 秦岭链霉菌超声波诱变结果
  • 5.4.5 Ms-24 菌株遗传稳定性
  • 5.5 讨论
  • 第六章 秦岭链霉菌与MS-24 菌株的原生质体融合
  • 6.1 材料与方法
  • 6.1.1 供试菌株
  • 6.1.2 培养基
  • 6.1.3 菌丝体的培养
  • 6.1.4 双亲原生质体灭活
  • 6.1.5 原生质体再生
  • 6.1.6 原生质体融合
  • 6.1.7 融合菌株活性的筛选
  • 6.1.8 融合子遗传稳定性的测定
  • 6.2 结果与分析
  • 6.2.1 甘氨酸浓度对原生质体制备的影响
  • 6.2.2 溶菌酶浓度对原生质体制备、再生的影响
  • 6.2.3 酶解时间对原生质体制备、再生的影响
  • 6.2.4 聚乙二醇对原生质体融合的影响
  • 6.2.5 紫外线照射时间对原生质体灭活的影响
  • 6.2.6 温度对Ms-24 菌株热灭活的影响
  • 6.2.7 融合子的抑菌活性测定
  • 6.2.8 融合子pf77，pf126 和pf138 菌株遗传稳定性
  • 6.3 讨论
  • 第七章 秦岭链霉菌的发酵条件优化研究
  • 7.1 材料
  • 7.1.1 材料
  • 7.1.1.1 菌种
  • 7.1.1.2 培养基原料
  • 7.2 方法
  • 7.2.1 斜面培养
  • 7.2.2 种子培养
  • 7.2.3 摇瓶发酵
  • 7.2.4 抑菌活性测定
  • 7.3 结果与分析
  • 7.3.1 发酵培养基配方的选择
  • 7.3.1.1 碳源的选择
  • 7.3.1.2 氮源的选择
  • 7.3.1.3 金属离子对秦岭链霉菌产抗的影响
  • 2+、Ca2+离子对秦岭链霉菌发酵液生物活性的影响'>7.3.1.4 Mg2+、Ca2+离子对秦岭链霉菌发酵液生物活性的影响
  • 7.4 秦岭链霉菌的发酵条件优化
  • 7.4.1 初始pH 的影响
  • 7.4.2 种龄和接种量的影响
  • 7.4.3 发酵条件的正交试验
  • 7.5 讨论
  • 第八章 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 作者简介
  • 论文发表情况
  • 申请专利情况
  • 参编著作

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