根结线虫16D10基因转化黄瓜的研究

论文摘要

黄瓜是我国重要的蔬菜作物之一,随着生物技术的快速发展,植物基因工程已为黄瓜抗性育种提供了一条崭新而有效的方法,克服了传统育种方法上的远缘杂交困难等问题,拓宽了种质来源,加速了抗性品种的选育进程。本试验采用RT-PCR方法从被线虫侵染的黄瓜根系cDNA中扩增出根结线虫保守基因16D10,构建由35S启动子调控的16D10基因的植物表达载体pBIN-16D10。通过根癌农杆菌介导法,以不同黄瓜品系Z×J,小天使2号和007的两天苗龄的子叶为外植体,将16D10基因转化到黄瓜体内;同时也利用花粉管通道法进行转化,以期研究16D10基因对黄瓜根系生长的影响和对根结线虫侵染的影响。本试验的主要结果如下:1提取带有根结线虫的黄瓜根系总RNA,利用RT-PCR扩增出根结线虫保守基因16D10,连接到T载体pMD-18上,测序表明所扩增的序列与已发表的四种主要根结线虫（南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫）序列具有很高的同源性。2构建了由35S启动子调控的含有目的基因的克隆载体pRTL2-16D,用HindⅢ从重组质粒中切下16D10基因片段,插入到双元表达载体pBIN-19上,得到表达载体pBIN-16D10。3 Kan抗性筛选表明:50 mg/L的Kan可完全抑制子叶再生芽的分化。用此浓度可完全满足对根癌农杆菌转化后植株进行初步筛选的需要。4农杆菌介导的基因转化后,再生芽诱导分化培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LABA+20 mg/L Ades+300mg/L Cef+50mg/L Kan,芽伸长培养基为MS+0.5 mg/LGA3+150 mg/L Cef+50 mg/L Kan,苗高2cm的再生植株转移到生根培养基:MS+0.5 mg/LIBA+150 mg/L Cef+50 mg/L Kan。不同基因型的出芽率为Z×J＞小天使2号＞007,共得到抗性芽50个,大部分植株难以伸长生长,中途死亡。5利用花粉管通道法将16D10基因转入黄瓜植株中,在经3 000 mg/L Kan涂抹叶片初步筛选的基础上,对抗性苗进行PCR检测,目前检测到1株PCR阳性植株。其他分子检测正在进行中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 植物基因工程
• 1.1.1 植物遗传转化方法
• 1.1.2 转基因植物的检测与鉴定
• 1.2 植物基因工程的应用情况
• 1.2.1 黄瓜组织培养
• 1.2.2 黄瓜遗传转化研究进展
• 1.2.3 其它葫芦科作物遗传转化研究进展
• 1.2.4 存在的不足之处
• 1.3 研究意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒载体
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 试验地点
• 2.1.7 试验中所使用的引物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 表达载体构建过程中所涉及的试验方法
• 2.2.2 根癌农杆菌介导的黄瓜遗传转化
• 2.2.3 花粉管通道法介导的遗传转化
• 3 结果与分析
• 3.1 16D10基因表达载体的构建体系
• 3.1.1 16D10基因的获得
• 3.1.2 pMD-16D10重组子鉴定结果
• 3.1.3 表达载体的检测结果
• 3.2 农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系
• 3.2.1 外植体培养
• 3.2.2 Kan选择压的筛选
• 3.2.3 农杆菌介导的16D10基因转化
• 3.3 花粉管通道法介导的遗传转化抗性筛选
• 3.3.1 Kan筛选
• 3.3.2 转化黄瓜的检测
• 4 讨论
• 4.1 基因型对诱导分化的影响
• 4.2 外植体的选择对转化的影响
• 4.3 抗生素在转化中的应用
• 4.3.1 筛选标记的应用
• 4.3.2 Cef的应用
• 4.4 影响遗传转化的主要因素
• 4.4.1 农杆菌侵染
• 4.4.2 花粉管通道
• 4.5 两种转化方法的在黄瓜转化上的应用
• 4.6 植物表达载体
• 5 结论
• 5.1 构建黄瓜表达载体
• 5.2 黄瓜组织培养
• 5.3 转基因植株的获得
• 参考文献
• 附录
• 缩略语
• 致谢
• 个人简介
• 硕士期间发表论文情况