受体骨髓间充质干细胞抑制大鼠异位小肠移植急性排斥反应机制的实验研究

论文摘要

第一部分大鼠异位节段性小肠移植急性排斥反应模型的建立目的建立近交系BN-Lew大鼠异位节段性小肠移植的动物模型,通过移植物病理组织学观察,确定急性排斥反应的合适研究时间点。方法利用显微外科技术分别构建BN-Lew异系和Lew-Lew同系两组大鼠异位节段性小肠移植模型,术后1、3、5、7天分别留取移植肠组织进行HE染色,观察排斥反应的发生及程度。结果BN-Lew异系移植肠术后第3天开始出现轻度急性排斥反应,第5-7天出现严重的急性排斥反应。Lew-Lew同系移植肠无明显急性排斥反应发生。结论BN-Lew大鼠异位节段性小肠移植模型可以发生急性排斥反应,术后第7天为合适的研究时间点。第二部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定以及体外免疫抑制功能的实验研究目的体外分离、培养和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,对大鼠骨髓间充质干细胞体外免疫抑制功能进行研究。方法采用全骨髓贴壁培养法进行MSCs的分离、培养,传代扩增,利用流式细胞技术进行表型鉴定。以供鼠脾细胞作为反应T细胞,受鼠MSCs为刺激细胞,ConA作为T细胞增殖刺激因子,建立混合淋巴细胞培养体系。分4组进行对比研究：①脾细胞；②脾细胞+MSCs;③脾细胞+ConA;④脾细胞+ConA+MSCs。共孵育72小时后应用流式细胞仪检测T细胞亚群CD4+和CD8+的表达,分析MSCs对T细胞增殖的抑制作用。结果①体外分离的原代MSCs在48-72小时大部分贴壁,3周左右达到90%汇合,细胞形态由圆形过度到梭形。②流式细胞技术检测第3代MSCs表面标记物CD29、CD90阳性率大于95%,CD45阳性率低于5%。③CD4+细胞比例：脾细胞+MSCs组与脾细胞+ConA组间无差别,其它组间差异显著；脾细胞+ConA+MSCs组与脾细胞+ConA组差异最显著；CD8+细胞比例：脾细胞组与脾细胞+MSCs组、脾细胞+ConA组和脾细胞+ConA+MSCs组间无差异,脾细胞+MSCs组、脾细胞+ConA组和脾细胞+ConA+MSCs （?）（?）间差异显著；CD4/CD8：除脾细胞+ConA组和脾细胞+ConA+MSCs组间无差异外其余组间差异均有显著性。结论全骨髓帖壁培养法可取得较高纯度的MSCs,大鼠骨髓MSCs增殖能力强,可多次传代。MSCs在体外具有机制T淋巴细胞增殖的作用,以对CD4+的抑制为主,对CD8+的抑制作用不明显。第三部分受体骨髓间充质干细胞抑制大鼠小肠移植急性排斥反应机制的研究目的研究受体骨髓间充质干细胞抑制大鼠小肠移植急性排斥反应的机制。方法将实验动物随机分为4组：①Lew-Lew同系对照组；②BN-Lew急性排斥组；③急性排斥+FK506治疗对照组；④急性排斥+MSCs治疗组。术后第7天留取移植肠标本,病理切片观察排斥反应程度。PCRArray的方法对大鼠免疫相关的所有细胞因子的基因转录水平进行检测分析比较。结果急性排斥组较同系对照组IDO和HGF表达显著降低,Tnfsf15表达显著升高；急性排斥+FK506治疗对照组较急性排斥组IDO和HGF表达显著升高,Tnfsf15和Igf2显著降低：急性排斥+MSCs治疗组较急性排斥组Tnfsf15显著降低,伴、Illa, VEGF-A, Igfbp6显著升高,Igf2, iNOs, Igfbpl Tgfbl的显著降低；急性排斥+MSCs治疗组较急性排斥+FK506治疗对照组IDO和Tgfb1显著降低,VEGF-A、I115和Ccr3显著升高；急性排斥+MSCs治疗组较同系对照组VEGF-A和I115显著升高,IDO、Igf2、Ifng、Lta、Tgfb1、Ccl4和I118显著降低；急性排斥+FK506治疗对照组较同系对照组Ccl4、CCR3、Igf2和Tgfb1显著降低。结论①IDO、HGF和Tnfsf15这三种细胞因子相关的途径在大鼠小肠移植急性排斥反应过程中发挥重要作用。②FK506能抑制IDO和HGF表达,上调Tnfsf15表达,有效抑制大鼠小肠移植急性排斥反应的发生。③MSCs主要是通过上调Tnfsf15的表达发挥抑制急性排斥的作用,不能完全抑制大鼠小肠移植急性排斥反应。MSCs的抑制效果弱于FK506,但免疫耐受相关因子的表达,提示MSCs不仅可以抑制小肠移植急性排斥反应,还可能诱导免疫耐受。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、大鼠小肠移植急性排斥反应模型的建立
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.1.3 移植肠病理组织学检测
• 1.1.4 统计学方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 术后成活率
• 1.2.2 移植后体重变化
• 1.2.3 移植肠病理组织学和外观表现
• 1.3 讨论
• 1.3.1 肠系膜血管的重建
• 1.3.2 供肠的获取
• 1.3.3 血管吻合技术要点
• 1.3.4 术后补液
• 1.3.5 急性排斥反应的病理表现
• 1.4 小结
• 二、大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定和体外免疫抑制功能的实研究
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 骨髓间充质干细胞的分离和原代培养
• 2.1.5 间充质干细胞的传代扩增
• 2.1.6 细胞计数方法
• 2.1.7 流式细胞仪鉴定纯度
• 2.1.8 细胞的冻存
• 2.1.9 细胞的复苏
• 2.1.10 反应细胞的制备
• 2.1.11 刺激细胞悬液的制备
• 2.1.12 混合淋巴细胞培养反应体系的制备
• 2.1.13 淋巴细胞增殖检测
• 2.1.14 细胞接种及培养
• 2.1.15 细胞收集
• 2.1.16 统计学方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 倒置显微镜观察细胞形态
• 2.2.2 MSCs细胞表型
• 2.2.3 细胞冻存与复苏的结果
• 2.2.4 混合淋巴细胞培养后细胞图片
• 2.2.5 混合淋巴细胞培养检测结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 MSCs的原代培养
• 2.3.2 MSCs的传代培养
• 2.3.3 MSCs的表型鉴定
• 2.3.4 MSCs体外抑制T细胞增殖
• 2.4 小结
• 三、受体骨髓间充质干细胞抑制大鼠异位小肠移植急性排斥反应机制的研究
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 受体骨髓间充质干细胞的制备
• 3.1.2 大鼠异位小肠移植急性排斥反应模型的建立
• 3.1.3 药物试剂
• 3.1.4 仪器设备
• 3.1.5 大鼠异位小肠移植模型的建立
• 3.1.6 受体骨髓MSCs的输注
• 3.1.7 供肠标本的获取
• 3.1.8 移植肠的病理组织检测
• 3.1.9 移植肠基因表达的检测方法
• 3.1.10 PCR芯片检测基因的选择
• 3.1.11 统计学方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 移植肠病理组织学表现和外观
• 3.2.2 移植肠细胞因子的PCR芯片表达结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 大鼠小肠移植急性排斥反应的机制
• 3.3.2 FK506抑制大鼠小肠移植急性排斥反应的机制
• 3.3.3 MSCs抑制大鼠小肠移植急性排斥反应的机制
• 3.4 小结
• 全文结论
• 论文创新点
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述 骨髓间充质干细胞与移植免疫的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢