论文摘要
目的：免疫异常激活和免疫失衡是哮喘等气道高反应性疾病发生和持续存在的主要免疫学基础。外源性抗原通过抗原提呈细胞激活淋巴细胞,诱导T淋巴细胞增殖和分化,激活免疫反应。由于辅助性T淋巴细胞（Th细胞）亚群异常漂移使免疫细胞因子过高表达,导致哮喘发病。近年来认为气道上皮在气道高反应的免疫失衡机制中可能发生作用。气道上皮不再被仅仅看作为单纯的机械屏障,而是机体内环境与外部环境相互作用的界面,参与气道局部微环境稳态的维持和调节。已知气道上皮具有分泌炎性因子、趋化免疫细胞以及抗原提呈等功能,其结构和功能的异常将导致哮喘易感性增加,有可能成为哮喘发病的启动环节。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial viruses, RSV）是引起婴幼儿和成人毛细支气管炎和肺炎的主要病原体。临床流行病学证据显示,RSV感染可使哮喘发生的危险性显著增加,但其具体机制尚不清楚。本研究假设,由于RSV的嗜上皮特性,其进入机体后首先感染气道上皮组织,改变了气道上皮细胞的免疫调控方式,诱导机体免疫异常激活和免疫失衡,包括气道上皮细胞的分泌模式转变、过度释放炎性介质,从而导致Th细胞亚群异常漂移,形成哮喘的免疫易感体质。为求证这一学术思想,本研究拟建立人支气管上皮细胞（HBECs）持续感染RSV模型,观察外周血淋巴细胞被该模型激活后Th亚群的漂移及淋巴细胞因子的释放情况,以证实HBECs持续感染RSV后改变免疫平衡状态,进而探讨其分子机制,筛选并证实分子靶点。研究内容展开如下：（1）建立人支气管上皮细胞（HBECs）持续感染RSV模型,观察该模型对淋巴细胞的活化作用以及Th细胞亚群分布的影响；（2）分别制备正常HBECs和持续感染RSV的HBECs的基因芯片,观察其mRNA的差异表达,并筛选出编码分泌蛋白的差异基因；（3）验证明显上调的编码分泌蛋白的差异基因,观察该基因编码的分泌蛋白对Th亚群分化的调控功能并初步探讨其信号转导机制。方法与结果1.RSV感染人支气管上皮细胞（HBECs）对淋巴细胞的活化作用1)构建RSV持续感染HBECs模型用TCID50法测定RSV毒株的毒力为1.4×106 pfu/mL,设定感染复数（MOI）为0.0001,构建RSV持续感染HBECs模型。该模型具有以下典型特征：①感染细胞仍能够继续分裂传代；②传代后的感染细胞内可检测到RSV持续存在的证据。光镜下可见部分感染细胞晚期出现融合病变；免疫荧光显示细胞内有RSV致病蛋白的荧光表达；电镜下感染细胞的线粒体水肿,内质网扩张,出现核周裂隙,胞浆内有大量的溶酶体,胞核、胞浆内均有病毒颗粒分布。2) HBECs持续感染RSV后对淋巴细胞的活化作用体外分离外周血淋巴细胞,将其分为淋巴细胞组（L组）、RSV作用于淋巴细胞组（RL组）、正常HBECs与淋巴细胞共培养组（HL组）、RSV持续感染HBECs与淋巴细胞共培养组（HRL组）,24小时后分别收获各组淋巴细胞和上清液。PI染色、流式细胞技术测定淋巴细胞的凋亡率和细胞周期,结果显示HRL组的S期（有丝分裂期）的细胞比例和凋亡率在四组中均最高,其次是HL组的S期细胞比例也高于L组和RL组。此项数据说明感染RSV后的HBECs可诱导淋巴细胞显著增殖,同时又加速淋巴细胞的凋亡。正常HBECs也可刺激淋巴细胞在一定程度上增殖。单独RSV对淋巴细胞的增殖和凋亡无明显作用。ELISA法检测上清液中淋巴细胞因子IL-4, IFN-γ和IL-17的水平,发现RSV持续感染HBECs可促使淋巴细胞大量分泌IL-4. IFN-γ和IL-17等细胞因子,正常HBECs可刺激淋巴细胞分泌一定量的IFN-γ，单独RSV对淋巴细胞无明显激活作用。3)RSV感染HBECs的上清液调控Th亚群的分化我们将细胞培养液、正常HBECs的上清液以及RSV持续感染HBECs的上清液分别作用于淋巴细胞24小时,免疫荧光染色后流式细胞仪测定淋巴细胞中Th2、Th17以及Treg亚群的分布。结果显示感染RSV的HBECs上清液可促进Th2和Th17的分化并且抑制Treg的分化,正常HBECs也可一定程度上促进Th2和Th17亚群的分化。第一部分结果说明RSV感染HBECs可促进淋巴细胞增殖、凋亡,淋巴细胞因子的释放和Th亚群异常漂移,对淋巴细胞具有活化作用。2.人支气管上皮细胞（HBECs）感染RSV后的差异基因表达制备正常HBECs和持续感染RSV的HBECs的mRNA基因芯片,进行基因表达谱差异分析,筛选出HBECs持续感染RSV后的差异表达基因。基因芯片结果显示,相对于正常HBECs,感染RSV的HBECs内有349个基因表达上调,154个基因表达下调。差异基因中,有12个基因编码分泌蛋白,其中3个基因表达下调,9个基因表达上调。分泌谱中,CYR61基因是显著下调表达（ratio<0.2）, GVIN1、LEP和IL8基因是显著上调表达（ratio>5）。第二部分结果提示RSV持续感染HBECs后其mRNA表达明显改变,从而引起支气管上皮细胞的局部微环境发生变化。3.白介素8（IL-8）和瘦素（leptin）介导人支气管上皮细胞（HBECs）感染RSV后致Th亚群漂移作用根据之前基因芯片的结果测得感染RSV后的HBECs中有12个编码分泌蛋白的基因呈现差异表达,其中上调水平最高的两个基因分别是IL8和LEP,它们编码的蛋白分别是白介素8（IL-8）和瘦素（leptin）。荧光定量PCR检测IL-8和瘦素mRNA的表达,结果与基因芯片一致,即HBECs在持续感染RSV后,其细胞内IL-8和瘦素mRNA的表达相对于正常HBECs显著上调。ELISA检测正常HBECs和RSV持续感染HBECs的细胞上清液中IL-8和瘦素的水平。结果显示RSV感染组的IL-8和瘦素的水平明显高于对照组,说明HBECs持续感染RSV后过度分泌IL-8和瘦素等细胞因子。参照ELISA检测所得的感染RSV的HBECs的细胞上清液中IL-8和瘦素的平均浓度,我们将重组人IL-8和瘦素作用于外周血淋巴细胞,24小时后流式细胞仪检测淋巴细胞中Th2、Th17和Treg亚群的分布情况。结果显示IL-8和瘦素都可促进Th2和Th17亚群的分化,尤其是瘦素。不仅如此,IL-8与瘦素具有协同作用,共同使Th2的分化愈加增强。而IL-8和瘦素对Treg的分化均无影响。Western blotting和免疫荧光检测淋巴细胞中细胞外信号调节激酶1/2 （ERK1/2）的表达及其磷酸化水平。结果显示,IL-8和瘦素都可以促进ERK1/2的磷酸化。第三部分结果说明HBECs感染RSV后能够过度分泌IL-8和瘦素,而IL-8和瘦素可能是通过活化ERK1/2信号分子来促进Th2和Th17细胞亚群的分化。结论人支气管上皮细胞（HBECs）持续感染RSV后活化外周血淋巴细胞,引起Th亚群异常漂移。同时,HBECs感染RSV后过度分泌的IL-8和瘦素可能通过活化ERK1/2信号分子在引起Th亚群漂移中发挥作用。
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