利用杆状病毒表达感染性猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是猪繁殖与呼吸综合征病原,可引致怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病。该病毒流行广,对养猪业的影响大。目前,我国主要通过疫苗接种预防该病。但该疫苗生产的基质细胞MA104和Marc-145细胞为国外专利垄断。为了免受外国专利限制,开辟了一种新的PRRSV疫苗的呈递途径,本文利用杆状病毒,作了如下研究:1 PRRSV重组杆状病毒的构建利用bac-to-bac系统,将PRRSV APRRS全长cDNA重组入杆状病毒中,构建了重组杆状病毒AcAPRRS。AcAPRRS在sf9细胞上连续传5代,通过对嵌合处序列分析,证实AcAPRRS具有较好的稳定性。比较了AcAPRRS与空载体杆状病毒AcLacZ在sf9细胞上的生长曲线,结果显示AcAPRRS具有与AcLacZ相近的生长动力特性。以Northern blot和间接免疫荧光检测了PRRSV基因在sf9细胞中的转录和表达,结果显示,AcAPRRS感染sf9细胞后,有低水平的PRRSV亚基因组转录和N蛋白的表达。上述结果表明,本文获得了稳定的PRRSV重组杆状病毒AcAPRRS。2重组杆状AcAPRRS产生子代PRRSV的特性研究以AcAPRRS接种Marc-145细胞,以间接免疫荧光,可检测到PRRSV N蛋白的表达。在Marc-145上清及传代上清中,均可检测到PRRSV序列。分析了子代病毒vASM在Marc-145上一代和二代的5’和3’末端序列,结果显示,vASM具有与分离株相同的基因组末端序列。比较了vASM与亲本病毒APRRS的生长特性,结果显示,vASM与APRRS相同的空斑形态,vASM的生长曲线也与APRRS的相近。上述结果表明,杆状病毒能不影响呈递产生的子代病毒的生物学特性,是理想的外源病毒基因组序列呈递载体。3重组杆状病毒AcAPRRS转导PRRSV非敏感细胞系的研究以AcAPRRS接种BHK-21细胞和vero细胞,间接免疫荧光显示,BHK-21细胞和vero细胞中部分存在PRRSV N蛋白的表达。以BHK-21细胞和vero细胞上清接种Marc-145细胞,2d后即出现CPE。以RT-PCR检测了BHK-21细胞和vero细胞上清及传代Marc-145细胞的上清,均存在PRRSV序列。测定了AcAPRRS接种后,BHK-21细胞和vero细胞上产生PRRSV的滴度曲线,BHK-21细胞和vero细胞产生的PRRSV的滴度最高可达104.5 TCID50/ml。上述结果表明,杆状病毒可向细胞呈递其非敏感的病毒基因组序列并产生病毒,为开拓PRRSV疫苗新的呈递途径打下良好基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 杆状病毒的分子生物学及其应用的研究进展
• 1.1 杆状病毒的分类
• 1.2 杆状病毒的基因组结构及复制与表达
• 1.2.1 杆状病毒的基因组
• 1.2.2 杆状病毒的变异
• 1.2.3 杆状病毒的感染循环和基因表达
• 1.2.4 杆状病毒的主要基因及其功能
• 1.3 杆状病毒在生物科学研究中的应用
• 1.3.1 杆状病毒表达系统的发展
• 1.3.2 杆状病毒在昆虫细胞中表达异源蛋白
• 1.3.3 杆状病毒展示技术
• 1.3.4 杆状病毒介导基因在哺乳细胞中表达
• 1.3.5 杆状病毒载体在疫苗开发中的应用
• 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒及其疫苗的研究进展
• 2.1 病毒分类及理化特性
• 2.2 病毒的培养
• 2.3 病毒的基因组结构及编码蛋白
• 2.4 病毒的致病机理
• 2.5 病毒的变异
• 2.6 病毒在猪体内的持续性感染
• 2.7 PRRSV 疫苗的研究进展
• 2.7.1 灭活疫苗
• 2.7.2 弱毒活疫苗
• 2.7.3 新型疫苗的开发
• 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组杆状病毒的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 引物
• 3.1.4 重组供体质粒的构建
• 3.1.5 重组BACMID 的筛选
• 3.1.6 重组杆状病毒的获得与鉴定
• 3.1.7 重组杆状病毒在SF9 细胞上的稳定性
• 3.1.8 ACAPRRS 与ACLACZ 在 SF9 细胞上的生长曲线
• 3.1.9 IFA
• 3.1.10 NORTHERN BLOT
• 3.2 结果
• 3.2.1 供体质粒PBACAPS
• 3.2.2 重组杆状病毒ACAPRRS
• 3.2.3 ACAPRRS 的稳定性
• 3.2.4 ACAPRRS 的生长曲线
• 3.2.5 PRRSV 基因在 SF9 细胞中的表达
• 3.2.6 SF9 细胞中 PRRSV 亚基因组的转录
• 3.3 讨论
• 第四章 重组杆状 ACAPRRS 产生子代PRRSV 的特性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 引物
• 4.1.4 IFA
• 4.1.5 ACAPRRS 转导 MARC-145 细胞后子代 PRRSV 病毒的产生
• 4.1.6 5’-RACE 和3’-RACE
• 4.1.7 SF9 细胞上清转导MARC-145 细胞
• 4.1.8 空斑试验
• 4.1.9 一步生长曲线
• 4.2 结果
• 4.2.1 ACAPRRS 转导MARC-145 细胞后N 蛋白的表达
• 4.2.2 子代 PRRSV 的检测
• 4.2.3 VASM 的末端序列
• 4.2.4 SF9 细胞上清对 MARC-145 细胞转导的变化
• 4.2.5 VASM 病毒的生长特性分析
• 4.3 讨论
• 第五章 重组杆状病毒 ACAPRRS 转导 PRRSV 非敏感细胞系的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 主要仪器
• 5.1.3 ACAPRRS 转导BHK-21 细胞后PRRSV N 蛋白的表达
• 5.1.4 ACAPRRS 转导BHK-21 细胞产生感染性PRRSV 的检测
• 5.1.5 ACAPRRS 转导VERO 细胞后 PRRSV N 蛋白的表达
• 5.1.6 ACAPRRS 转导VERO 细胞产生感染性PRRSV 的检测
• 5.1.7 ACAPRRS 转导BHK-21 细胞和 VERO 细胞后产生PRRSV 的动力曲线
• 5.2 结果
• 5.2.1 PRRSV N 蛋白在 BHK-21 细胞中的表达
• 5.2.2 BHK-21 细胞中感染性PRRSV 颗粒的产生
• 5.2.3 ACAPRRS 转导VERO 细胞后PRRSV N 蛋白的表达
• 5.2.4 VERO 细胞中感染性 PRRSV 颗粒的产生
• 5.2.5 BHK-21 细胞和 VERO 细胞上 PRRSV 的生产曲线
• 5.3 讨论
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 附录Ⅰ 重组杆状 AcAPRRS 中 PRRSV 克隆序列 5’与杆状病毒载体序列嵌合处序列
• 附录Ⅱ重组杆状 AcAPRRS 中 PRRSV 克隆序列 3’与杆状病毒载体序列嵌合处序列
• 附录Ⅲ vASM F1 5’末端序列
• 附录Ⅳ vASM F1 3’末端序列
• 附录Ⅴ vASM F2 5’末端序列
• 附录Ⅵ vASM F2 3’末端序列
• 附录Ⅶ 文中免疫荧光照片