野油菜黄单胞菌野油菜致病变种panD基因的功能研究

论文摘要

泛酸是乙酰辅酶A基本前体,乙酰辅酶A在生物大分子分解代谢和三羧酸循环过程起着重要作用。在大肠杆菌中,用于泛酸生物合成的的β-丙氨酸主要是由L-天冬氨酸 α位脱羧而产生,这个生化反应由panD基因编码的L-天冬氨酸-α-脱羧酶催化。大肠杆菌panD基因突变体为β-丙氨酸营养缺陷型。在Xcc 8004基因组中存在一个与大肠杆菌panD基因高度同源的基因（ORF编号为XC2380,其编码的蛋白与大肠杆菌的PanD蛋白氨基酸序列有70.6%的相似性）。同时,在本实验室构建的Xcc 8004 Tn5gusA5插入突变体库中,得到了一个插入位点在panD基因的突变体121C07,通过与其转录下游基因突变体表型对比确定121C07对其下游基因没有极性效应。对121C07进行了一系列的表型检测,发现121C07和野生型Xcc 8004一样都能在基本培养基（MMX,不含β-丙氨酸）上生长,这说明121C07不是β-丙氨酸营养缺陷型。这一结果表明,Xcc 8004中泛酸合成途径与大肠杆菌存在一定的差异。用剪叶法,以OD600同为0.001浓度接种寄主植物中华萝卜（Raphanus sativus L.var.radiculus Pers.）,发现突变体的致病力有所下降（接种10天后平均病斑长度为:野生型Xcc 8004 12.29毫米,panD突变体121C07为4.56毫米）。对121C07进行EPS产量分析,121C07

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 植物病原菌一野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xcc）的概述
• 1.1.1 Xcc的分类地位
• 1.1.2 Xcc的形态和特征
• 1.1.3 Xcc引起的侵染过程及症状
• 1.1.4 Xcc基因组的分析
• 1.2 植物病原菌致病因子研究
• 1.2.1 依赖于Ⅲ型分泌系统（TTSS）的效应物
• 1.2.2 胞外酶
• 1.2.3 多糖
• 1.2.4 毒素
• 1.2.5 生长激素
• 1.3 胞外多糖（EPS）研究进展
• 1.3.1 胞外多糖的结构
• 1.3.2 胞外多糖的理化性能
• 1.3.3 胞外多糖的应用
• 1.3.4 胞外多糖生物合成途径及调控
• 1.3.5 胞外多糖与致病性
• 1.4 panD基因研究进展
• 1.4.1 大肠杆菌中panD基因功能研究
• 1.4.2 棒状杆菌中panD功能研究
• 1.4.3 结核分支杆菌中panD功能研究
• 1.4.4 茄青枯甲单胞茵中panD功能研究
• 1.5 本工作的目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基及生长条件
• 2.1.3 抗生素及其贮存、使用浓度
• 2.1.4 溶液与缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 常规PCR反应
• 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.3 PCR产物的回收与纯化
• 2.2.4 细菌总DNA的提取
• 2.2.5 质粒的提取
• 2.2.6 限制性内切酶酶切
• 2.2.7 DNA连接
• 2.2.8 DNA的电脉冲转化
• 2.2.9 三亲本接合
• 2.2.10 突变体的功能互补
• 2.2.11 胞外多糖的检测
• 2.2.12 胞外酶的检测
• 2.2.13 致病性试验
• 2.2.14 细菌在培养基中的生长繁殖曲线的绘制
• 第三章 结果与分析
• 3.1 Xcc中存在一个编码蛋白与大肠杆菌PanD氨基酸序列高度同源的基因
• 3.2 panD突变体的获得
• 3.3 XC2380 Tn5gusA5插入突变体121C07与其转录下游基因XC2379的关系
• 3.4 互补菌株的构建
• 3.5 突变体在MMX培养基上的生长情况检测
• 3.5.1 平板检测
• 3.5.2 摇瓶培养绘制生长曲线
• 3.6 突变体的致病性实验
• 3.7 突变体的EPS产量检测
• 3.7.1 EPS的平板检测
• 3.7.2 EPS的摇瓶发酵检测
• 3.8 突变体的胞外酶检测
• 3.8.1 胞外蛋白酶
• 3.8.2 胞外纤维素酶
• 3.8.3 胞外淀粉酶
• 3.8.4 细胞分泌物胞外酶活性检测
• 3.9 突变体耐盐性检测
• 3.9.1 平板检测
• 3.9.2 摇瓶培养绘制生长曲线
• 第四章 讨论
• 4.1 Xcc中存在不同于大肠杆菌的泛酸生物合成途径
• 4.2 Xcc中panD基因与致病相关
• 4.3 Xcc中panD基因与Xcc细胞耐盐性有关
• 参考文献
• 附表一
• 附表二
• 附表三
• 附表四
• 致谢