高活性低分子量肝素的制备及活性研究

论文摘要

肝素是一种硫酸化的多糖,属于糖胺聚糖家族,主要从哺乳动物的肥大细胞中分离得到。肝素通过与其他不同蛋白结合,可以发挥重要的生物活性。它可以激活抗凝血酶,加速抗凝血酶在凝血连锁中抑制丝氨酸蛋白酶的速率,从而被作为一种抗凝血的药物被广泛的应用。由于肝素结构的多样性和分子量的多分散性,使其治疗窗窄,生物利用度低,半衰期短。此外肝素可能造成出血和诱导血小板减少（HIT）、骨质疏松等副作用。这些缺点限制了肝素在临床上的应用。因此,人们研制出了新型抗凝血药物,低分子量肝素（LMWH）。这类药物具有链短、结合部位少,生物利用度高,且半衰期长等优点。这种药物具有很好的医疗前景。本篇论文研究了β-消除降解法制备低分子量肝素钠的工艺路线,通过改变酯化时间和控制降解时间,制备出了最佳分子量范围的低分子量肝素钠。优化的反应条件为,酯化时间为25小时,酯化率为13.97%,分子量2000Da到8000Da的比例为71.1%；降解时间为1.5时,分子量2000Da到8000Da的比例为66.5%。低分子量肝素作为抗凝血药物虽然具备了许多优点,但是在制备过程中,降解导致部分戊糖活性中心被破坏。戊糖结构中N-,6-O-及3-O-位硫酸基参与结合AT-Ⅲ,与抗凝血活性有关,其中3-O-位硫酸化极为重要。因此,本篇文章重点研究了低分子量肝素活性的提高,通过酶修饰的反应,增加3-O-位硫酸化程度,大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的数量。反应过程中需用到两种酶,硫酸基转移酶（3-OST-I）和芳基硫酸基转移酶（AST-IV）,重组质粒转化到E.coliBL21（DE3）工程菌后,能稳定表达AST-IV和3-OST-I融合蛋白。经过Ni-NTA Agarose Fast Flow柱的分离纯化得到了纯度较高的酶,并且通过酶活性的测定,确定了酶的比活度。本篇文章用发色底物法,测定了修饰后低分子量肝素的抗FXa的活性,并用未修饰的低分子量肝素进行比较,经过测定FXa活性百分比,可以计算出低分子量肝素的半抑制率（IC50）,结果显示,Fragmin、Innohep和Lovenox三种低分子量肝素经过修饰后与未修饰之前相比,IC50值分别降低了3.3、8.7和2.4倍,说明修饰后,抗凝血活性大大增强了。本文最后探讨了3-OST-I修饰的肝素经过降解酶Heparinase的作用后,降解的寡糖片段分布。在过量的Heparinase作用下,肝素可彻底被降解成双糖单元,但是经过3-OST-Ⅰ修饰后的肝素,在硫酸化的葡萄糖胺与3-O-位硫酸化的葡萄糖醛酸之间的糖苷键,不能被Heparinase切断,降解后的肝素可得到带有3-O-位硫酸化的四糖。经过实验验证,修饰后四糖的含量提高了8.2倍,进而说明了修饰后的肝素,其活性中心数量得到了很大的提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 肝素及低分子量肝素的结构与功能
• 1.2.1 肝素及低分子量肝素的结构
• 1.2.2 肝素及低分子量肝素的功能
• 1.3 肝素及低分子量肝素的制备
• 1.3.1 肝素的制备
• 1.3.2 低分子量肝素的制备
• 1.4 肝素及低分子量肝素的优缺点比较及所存在的问题
• 1.4.1 肝素与低分子量肝素的优缺点比较
• 1.4.2 低分子量肝素存在的问题
• 1.5 低分子量肝素的结构修饰研究
• 1.5.1 低分子量肝素结构修饰的意义
• 1.5.2 结构修饰反应中PAPS再生系统的实现
• 1.5.3 结构修饰反应中硫酸基转移酶的作用
• 1.6 低分子量肝素的活性研究
• 1.6.1 发色底物法原理
• 1.6.2 发色底物测定方法
• 1.7 本课题研究意义
• 第二章 β-消除降解法制备低分子量肝素
• 2.1 引言
• 2.2 试剂与仪器
• 2.3 专利概述与反应机理的研究
• 2.3.1 相关背景
• 2.3.2 专利的概述
• 2.3.3 反应机理的研究
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 不同反应时间的酯化率的测定
• 2.4.2 不同降解时间对分子量的影响
• 2.4.3 产物重均分子量与分子量分布的测定
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 反应时间对酯化率的影响
• 2.5.2 降解时间对分子量的影响
• 2.6 本章小结
• 第三章 芳基硫酸基转移酶（AST-Ⅳ）,硫酸基转移酶（3-OST-1）及肝素降解酶（Heparinese-Ⅰ）的表达与纯化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料及设备
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验试剂与实验仪器
• 3.3. 实验方法
• 3.3.1 重组蛋白在E.coli BL21（DE3）中的表达
• 3.3.2 Ni-NTAAgarose Fast Flow色谱纯化重组蛋白
• 3.3.3 蛋白质含量的测定
• 3.3.4 表达及纯化产物的SDS-PAGE电泳测定
• 3.3.5 纯化后产物的比活度、纯化倍数和回收率计算方法
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 芳基硫酸基转移酶（AST-Ⅳ）的表达与纯化
• 3.4.2 硫酸基转移酶（3-OST-1）的表达与纯化
• 3.4.3 肝素降解酶（Heparinase-Ⅰ）的表达与纯化
• 3.5 本章小结
• 第四章 高活性低分子量肝素的制备、活性测定及结构初探
• 4.1 引言
• 4.2. 实验材料及设备
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验试剂与实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 高活性低分子量肝素的制备与纯化
• 4.3.2 高活性低分子量肝素的活性测定
• 4.3.4 高活性低分子量肝素的结构初探
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.3 高活性低分子量肝素活性测定
• 4.4.3 高活性低分子量肝素的结构初探
• 4.5. 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 硕士期间发表论文及专利