旋毛虫49ku ES抗原基因核酸疫苗构建及免疫保护作用研究

论文摘要

本研究根据GenBank中已发表的序列（M64242）为参考设计引物,用SDS裂解液配合蛋白酶K的方法提取总RNA,用RT-PCR方法从黑龙江猪、犬、猫旋毛虫,美国猪旋毛虫、旋毛形线虫、本地毛形线虫6个旋毛虫隔离种的成囊前期幼虫及黑龙江猪旋毛虫不同发育时期（成囊前期幼虫、肌幼虫、成虫）虫体中扩增出了带有Kozak序列的49ku ES抗原基因,将目的基因定向克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1。构建了重组质粒pMD18-T-S/EL、pMD18-T-D/EL、pMD18-T-C/EL、pMD18-T-AS/EL、pMD18-T-T1/EL、pMD18-T-T2/EL,pMD18-T-S/ML和pMD18-T-S/AM,经PCR、限制性内切酶EcoRI和BamHI进行单、双酶切鉴定,阳性质粒测序。成功克隆了6个旋毛虫隔离种成囊前期幼虫及猪旋毛虫不同发育时期虫体49ku ES抗原基因。序列分析结果显示:49ku ES抗原基因由起始密码子到终止密码子的核苷酸长为951bp,包含完整的阅读框,编码316个氨基酸残基。所获6个旋毛虫隔离种基因序列经同源性分析表明,6个旋毛虫隔离种与GenBank上发表的序列核苷酸的同源性为97.0%～97.5%,推导氨基酸的同源性为93.4%～94.6%。6个隔离种之间的同源性为99.3%～99.9%,基因的保守性很强,不同隔离种之间的差异很小,其编码蛋白的抗原性也基本相同。所获猪旋毛虫不同发育时期虫体基因序列经同源性分析表明,猪旋毛虫成囊前期期幼虫、肌幼虫和成虫与GenBank中已知序列的同源性分别为,97.5%、97.3%和97.3%;猪旋毛虫不同发育时期虫体之间具有高度同源性,成囊前期幼虫与肌幼虫的核苷酸序列同源性达99.8%,在第535位点上有一个T→C突变,在第665位点上有一个T→C突变;与成虫的同源性同样为99.8%,在第535位点上有一个T→C突变,在848位点上有一个A→G突变;肌幼虫与成虫相比,同源性为99.8%,在第665位C→T、在848位A→G。导致与之相对应的氨基酸序列发生相应的改变。其编码蛋白的抗原性也很稳定,同种不同发育时期虫体之间的差异很小。将真核表达载体pcDNA3.1（+）与pMD18-T-S/EL分别用BamHⅠ和EcoR I双酶切,胶回收纯化后连接。经PCR、酶切鉴定,证明P49-S/EL基因按设计要求已插入表达载体中,构建了真核表达载体pcDNA-P49-S/EL。将家兔随机分为A、B、C组,分别肌肉注射pcDNA3.1（+）、pcDNA3.1-P49-S/EL和pcDNA3.1-P49-S/EL+LipofectamineTM2000。每只家兔100μg/100μl,共免3次,每次间隔1周。首次免疫后第0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、51d采血分离血清用ELISA法检测抗体动态变化,同时检测外周血CD4+、CD8+T细胞动态变化。A组家兔血清在旋毛虫攻击感染后21d（42d）开始检出阳性抗体,然后迅速升高;B组家兔血清在免疫期间一直没能检出阳性抗体,而是在旋毛虫攻击感染后14d（35d）开始检出阳性抗体,而后迅速升高;C组家兔血清在3免后7d（21d）即可检出阳性抗体,旋毛虫攻击感染后,血清抗体OD值有所下降,而后呈逐渐上升趋势,第51d OD450达到2.128,与A、B两组相比差异极显著（P<0.01）。首次免疫后B组与C组家兔外周血CD4+T细胞减少;2次免疫后B组、C组仍然降低,

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 旋毛虫与旋毛虫病
• 1.1.1 病原分类与形态
• 1.1.2 生活史
• 1.1.3 流行病学
• 1.1.4 致病作用和病理变化
• 1.1.5 临床症状
• 1.1.6 诊断
• 1.1.7 治疗
• 1.1.8 预防
• 1.2 旋毛虫ES 抗原的研究进展
• 1.2.1 ES 抗原的分泌与成分组成
• 1.2.2 ES 抗原中的糖基
• 1.2.3 ES 抗原的酶活性
• 1.2.4 ES 抗原与营养细胞的形成
• 1.2.5 成虫的ES 抗原
• 1.2.6 ES 抗原的功能
• 1.2.7 基因重组ES 抗原
• 1.3 旋毛虫疫苗的研究进展
• 1.3.1 减毒活疫苗
• 1.3.2 天然抗原疫苗
• 1.3.3 合成肽疫苗
• 1.3.4 重组抗原疫苗
• 1.3.5 核酸疫苗
• 1.3.6 影响免疫效果的因素
• 1.3.7 对不同隔离种旋毛虫感染的免疫保护效果
• 1.3.8 小结
• 1.4 核酸疫苗的研究进展
• 1.4.1 核酸疫苗的结构与分类
• 1.4.2 核酸疫苗的免疫机理
• 1.4.3 核酸疫苗的特点
• 1.4.4 核酸疫苗的接种方法和途径
• 1.4.5 影响核酸疫苗免疫效果的主要因素
• 1.4.6 核酸免疫的新进展
• 1.4.7 核酸疫苗研究需要解决的几个问题
• 1.4.8 核酸疫苗的应用前景与展望
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 各隔离种旋毛虫
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 质粒与菌种
• 2.1.5 主要试剂及药品
• 2.1.6 主要实验仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 旋毛虫成囊前期幼虫（pre-encysted larvae EL）的收集
• 2.2.2 旋毛虫肌幼虫（musle larvae ML）的收集
• 2.2.3 旋毛虫成虫（adult worms AW）的收集
• 2.2.4 旋毛虫总RNA 的提取
• 2.2.5 RNA 的反转录和P49 基因的扩增
• 2.2.6 目的基因的分子克隆和鉴定
• 2.2.7 重组真核表达载体pcDNA-P49 的构建
• 2.2.8 核酸疫苗的免疫保护效果
• 3 结果
• 3.1 旋毛虫不同发育时期虫体收集
• 3.2 旋毛虫不同隔离种成囊前期幼虫49KU ES 抗原基因的克隆与序列分析
• 3.2.1 猪旋毛虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定
• 3.2.2 犬旋毛虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定
• 3.2.3 猫旋毛虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定
• 3.2.4 美国猪旋毛虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定
• 3.2.5 旋毛形线虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定
• 3.2.6 本地毛形线虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定
• 3.2.7 旋毛虫不同隔离种成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的序列分析
• 3.3 猪旋毛虫不同发育时期虫体49KU ES 抗原基因的克隆与序列分析
• 3.3.1 猪旋毛虫成囊前期幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定
• 3.3.2 猪旋毛虫肌幼虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定
• 3.3.3 猪旋毛虫成虫49ku ES 抗原基因的克隆与鉴定
• 3.3.4 猪旋毛虫不同发育时期虫体49ku ES 抗原基因的序列分析
• 3.4 重组真核表达载体PCDNA-P49 的构建
• 3.5 核酸疫苗的免疫效果
• 3.5.1 pcDNA3.1-P49-S/EL 免疫后的抗体检测
• 3.5.2 T 细胞亚类检测
• 3.5.3 pcDNA3.1-P49-S/EL 免疫对猪旋毛虫攻击感染的免疫保护作用
• 4 讨论
• 4.1 旋毛虫不同隔离种与旋毛虫不同发育阶段虫体
• 4.2 旋毛虫不同隔离种成囊前期幼虫49KU ES 抗原基因的克隆与序列分析
• 4.3 猪旋毛虫不同发育时期虫体49KU ES 抗原基因的克隆与序列分析
• 4.4 重组真核表达载体PCDNA-P49 的构建
• 4.5 核酸疫苗的免疫保护作用
• 4.5.1 抗体的检测
• 4.5.2 T 细胞亚类检测
• 4.5.3 pcDNA3.1-P49-S/EL 免疫对猪旋毛虫攻击感染的免疫保护作用
• 4.6 本实验的创新
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文