论文摘要
目的：1、观察VD缺乏对脊柱结核患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群及调节性淋巴细胞Treg分布的影响情况；观察VD缺乏对IL-2、IL-10表达的影响情况。2、观察VD缺乏对脊柱结核局部病灶中IFN-γ、TGF-β、IL-10及TNF-α表达的影响。3、初步探讨VD缺乏对脊柱结核免疫功能影响的可能机制，为进一步的临床试验提供依据。方法：1、实验对象的选择在2010年1月至2011年12月于西南医院骨科接受手术治疗的脊柱结核病人中选取合适对象作为研究组。纳入标准为：1、确诊脊柱结核；2、初治结核；3、营养状况正常；4、长期居住地重庆；5、无外地居住史；6、汉族；7、年龄；8、在16岁-65岁；9、有接种史；排除标准为：1、复发结核；2、白蛋白及血钙磷水平低于正常范围；3、有肝肾病史；4、甲状腺或甲状旁腺病史；5、血VD水平在25nmol/L至50nmol/L之间。最终入组109例。选取年龄分布同研究组相近、血白蛋白、血钙磷水平在正常范围、无肝肾功能异常、无结核病史的健康献血者为对照组，共40例。2、VD水平的测定及研究对象分组采用ELISA方法测定研究组、对照组外周血VD水平，在研究组中，VD水平高于50nmol/L为VD正常组，低于25nmol/L为VD缺乏组。按术中所见的病灶情况及影像学特点将研究组的病变程度分为增生型与干酪型两种类型，卡方检验分析病变类型构成比的组间差异。3、外周血相关免疫指标的检测分析采用流式细胞仪检测CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群及调节性淋巴细胞CD4+CD25+Foxp3+Treg的分布，采用ELISA方法测定细胞因子IL-2、IL-10的表达，采用单因素方差分析各指标的组间差异。4、局部病灶相关免疫指标的检测分析VD正常组和VD缺乏组通过手术取得病灶标本后，将脓液进行涂片、HE染色、IL-10和TNF-α免疫组化染色；将死骨进行石蜡包埋、切片、HE染色；将脓壁肉芽组织进行石蜡包埋、切片、HE染色、IFN-γ、TGF-β、IL-10和TNF-α免疫组化染色。观察局部病灶的形态学特点，分析各细胞因子在两组病灶中的表达差异。结果：1、研究组109例中，外周血VD水平高于50nmol/L为VD正常组，有48例，低于25nmol/L为VD缺乏组，有61例。2、对照组（n=40）血清VD水平为64.7±5.72nmol/L，VD正常组（n=48）血清VD水平为61.9±5.48nmol/L，VD缺乏组（n=61）血清VD水平为20.5±3.67nmol/L，VD正常组与对照组血清VD水平无显著差异，VD缺乏组血清VD水平显著低于其他两组（P＜0.01）。VD缺乏组病人中，病变类型属于干酪型的比例85.2%（52/61）较VD正常组39.6%（19/48）高，差异显著（P＜0.01）。3、三通道流式细胞术检测结果：①VD缺乏组CD4+T淋巴细胞亚群百分比为（38.18±3.64）%，显著高于VD正常组（35.92±3.47）%和对照组（35.61±2.95）%（P＜0.05）；VD缺乏组CD8+T淋巴细胞亚群百分比为（43.16±2.76）%，显著高于VD正常组（31.21±1.60）%和对照组（28.93±1.70）%（P＜0.01）；VD缺乏组CD4+/CD8+比值0.90±0.08，显著低于VD正常组1.26±0.10和对照组1.30±0.12（P＜0.01）。VD正常组与对照组无显著差异；②VD缺乏组CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞亚群占CD4+淋巴细胞百分比为（3.92±0.67）%，显著低于VD正常组（6.03±0.69）%和对照组（5.41±0.86）%（P＜0.05）。ELISA方法检测结果：①VD缺乏组血IL-2水平为67.42±6.23ng/L，显著高于VD正常组58.63±5.87ng/L和对照组56.35±7.55ng/L（P＜0.05）；②VD缺乏组血IL-10水平为12.63±2.20ng/L，显著低于VD正常组20.05±3.15ng/L和对照组18.48±2.90ng/L（P＜0.01）；4、免疫组化染色观察结果：①V D缺乏组脓液涂片IL-10表达较VD正常组低，TNF-α表达较VD正常组高，差异显著（P＜0.05）；②VD缺乏组脓壁肉芽组织石蜡切片IL-10、TGF-β表达较VD正常组低，IFN-γ、TNF-α表达较VD正常组高，差异显著（P＜0.05）。讨论：1、VD缺乏与脊柱结核干酪型病变密切相关。2、VD缺乏可使机体出现IL-2/IL-10比例失调，提示VD缺乏可能引起Th1/Th2失衡。3、VD缺乏间接造成CD4+T细胞占淋巴细胞百分比增加，并大量激活具有细胞毒性作用的CD8+T细胞， CD4+/CD8+比例倒置，使机体组织受到CD8+T细胞毒性作用的损伤。4、VD缺乏使介导Th2分泌IL-10上调CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)的通路受到抑制，Th2型反应减弱， Th1型反应增强，Th1/Th2平衡向Th1偏移，导致免疫损伤效应出现。5、VD缺乏使TNF-α过度表达，造成局部炎症反应，TGF-β低表达抑制肉芽组织纤维结构形成，减弱局部肉芽组织对结核菌的限制作用。6、VD缺乏脊柱结核局部病变IFN-γ与TNF-α过度表达，而IL-10、TGF-β低表达，出现细胞因子表达的严重失调，启动细胞毒性损伤机制。导致局部干酪坏死为主的免疫损伤效应。7、VD缺乏导致机体免疫保护和免疫损伤失衡，免疫损伤作用增强，而免疫保护作用减弱，造成脊柱局部组织的过度损伤、病变程度加重，实验结果提示补充VD可能促进免疫平衡恢复，利于脊柱结核病变修复。结论：1、VD缺乏可能引起Th1/Th2平衡向Th1偏移，表现为Th1细胞亚群过度活化，Th2细胞亚群抑制，感染结核的机体免疫损伤效应增强，免疫保护效应减弱。2、维持VD正常水平，可能促进免疫平衡恢复，有利于脊柱结核病变修复。
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